猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

赵少若,郝丽影,王同燕,贺笋,郑丁丁,李俊辉,白晨雨,王遵宝,宋欢欢,邓均华*,田克恭,*

(1.洛阳普泰生物技术有限公司，河南 洛阳 471000；2.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000；3.普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471000；4.天康生物股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830032)

猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起猪的高度接触性、致死性传染病。该病以发病急、持续高热、全身出血和白细胞减少为特征，对我国养猪业的危害极其严重，造成了巨大的经济损失。CSFV 属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)[1]，该属成员还包括牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)和边界病毒(border disease virus，BDV)。CSFV与BVDV的氨基酸序列同源性在85%以上，存在抗原交叉性和血清学交叉反应，猪感染BVDV可出现类似于猪瘟的临床症状和病理变化。猪瘟疫苗在生产过程中易受BVDV污染，导致病毒含量和疫苗效力严重下降，使免疫后的猪群产生大量针对BVDV的抗体,对猪瘟疫苗免疫后抗体水平监测造成影响，且BVDV污染的猪瘟疫苗免疫后可使猪群感染BVDV，给猪瘟的防控带来极大的安全隐患和不确定因素[2-3]。CSFV是单股正链RNA病毒，包括4种结构蛋白(C、Erns、E1、E2)和8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[4]。其中，E2蛋白是主要的免疫原性蛋白，也是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原，参与病毒感染过程以及诱导机体产生中和抗体[5]。它由ORF编码的690(Arg)至1060(Leu)之间的370个氨基酸组成，靠近E2蛋白N端上游有一段信号肽序列，在其C端有一段跨膜区[6]。以CSFV E2蛋白作为免疫原制备的单克隆抗体具有病毒中和能力，及高度的特异性和敏感性，能够识别病原结构的微小差异，且已有研究证明E2蛋白上存在可以区分BVDV和CSFV的抗原表位，因此CSFV E2在血清学诊断方法中具有重要的应用价值。

疫苗免疫是猪瘟防控的重要手段，特别是我国研制的猪瘟兔化弱毒疫苗对我国及全世界的猪瘟防控发挥了重要作用[7]。猪瘟抗体检测是评价疫苗免疫效果和制定疫苗免疫程序的依据，OIE推荐的方法有过氧化物酶联中和试验(NPLA)、荧光抗体病毒中和试验(FAVN)、酶联免疫吸附试验(ELISA)。NPLA和FAVN需要培养病毒、耗时耗力且不能实现大量样品的快速检测，并且存在生物安全风险，而ELISA方法以其快速、简便且能实现高通量检测被广泛应用。猪瘟病毒难纯化，使用重组CSFV E2蛋白作为ELISA试剂盒的包被抗原，不仅能大量生产，而且生物安全风险又小[8]。目前，用原核系统表达的CSFV E2蛋白多以包涵体形式存在，且缺少糖基化修饰[9-10]。而用杆状病毒表达系统表达的重组E2蛋白，不仅可分泌表达，而且表达的蛋白也可进行糖基化修饰[11-12]。本研究通过杆状病毒表达系统表达CSFV不含跨膜区的E2蛋白，经纯化后免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，研究证明1株单克隆抗体可用作诊断试剂。因此，将重组E2蛋白作为包被抗原，以HRP标记的单克隆抗体作为酶标试剂，建立了猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法，为猪瘟疫苗免疫效果评价和CSFV和BVDV的鉴别诊断提供了重要的技术保障。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

CSFV C株、CSFV阳性血清、CSFV抗原板由洛阳普泰生物技术有限公司提供；4～6周龄和6～8周龄的SPF BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司；Bac-to-Bac®HBM TOPO®Secreted Expression System试剂盒、sf9昆虫细胞购自上海Invitrogen公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；His亲和层析柱购自美国GE公司；HRP标记鼠抗His单克隆抗体购自MBL公司；HRP标记的羊抗猪IgG、HRP标记的羊抗鼠IgG购于Sigma公司；DAB显色试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司。

1.2 重组E2蛋白的表达、鉴定及纯化

参考猪瘟病毒C株(GenBank登录号AF531433)基因组序列，选择E2蛋白去除上游信号肽及下游跨膜区的序列，在蛋白末端添加His标签。将本公司已构建好的重组质粒Bacmid-E2转染sf9细胞，待80%细胞病变后收集上清作为P1代重组杆状病毒rBac-E2。将P1代rBac-E2感染sf9细胞，用CSFV阳性血清进行间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。然后将rBac-E2感染sf9细胞扩大培养，分别收获感染上清和细胞沉淀，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定E2蛋白分泌情况。将获得的重组E2蛋白按His亲和层析柱试剂盒说明书进行纯化，用BCA试剂盒测定其浓度后，分装后于-80℃保存备用。

1.3 动物免疫及间接ELISA方法的建立

将纯化的CSFV E2蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化混匀，背部皮下多点免疫BALB/c小鼠，100 μg/只。免疫间隔为2周，二免和三免使用弗氏不完全佐剂。三免后7 d采血，采用间接ELISA方法检测血清抗体效价，将纯化的CSFV E2蛋白稀释至0.5 μg/mL包被酶标板，100 μL/孔，4 ℃孵育16～24 h，洗板后加入封闭液，150 μL/孔，4 ℃封闭16～24 h。洗板后加入稀释后的待检血清，同时设置阴、阳性对照，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1∶10 000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min。洗板后分别加入显色剂A、B液，37 ℃显色15 min，用2 mol/L H2SO4终止反应，50 μL/孔。阴性对照OD450<0.2时，试验成立，S/N (待检样品OD450/阴性对照OD450)≥2.1时，判为阳性；S/N<2.1时，判为阴性，待检样品的效价为阳性孔对应的样品最高稀释度。

1.4 细胞融合及筛选

选取三免后血清效价最高的小鼠进行冲击免，3 d后按照常规方法进行细胞融合。采用1.3建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选，经过3次筛选及亚克隆后，获得稳定分泌特异性McAb的阳性杂交瘤细胞株。

1.5 CSFV阳性血清阻断试验

用纯化的CSFV E2蛋白包被酶标板，封闭过夜，加入阳性杂交瘤细胞上清，同时设置阴、阳性对照及空白对照，37 ℃孵育1 h，洗板后加入CSFV阳性血清，37 ℃孵育1 h，洗板后加入HRP标记的羊抗猪IgG，37 ℃孵育30 min，最后进行显色和终止反应，酶标仪读数并计算阻断率。

1.6 McAb识别抗原表位的鉴定

根据已报道的CSFV E2蛋白抗原表位[13]，选择了1个能区别CSFV和BVDV的线性表位序列TAVSPTTLR，构建重组GST表位多肽。以pGEX-6P-1空质粒为模板，设计引物引入表位序列及酶切位点NcoⅠ/XhoⅠ，PCR扩增出重组表位多肽序列。将其克隆于表达载体pET-28a构建重组质粒，转化至BL21，经IPTG诱导表达后，超声裂解破碎。将重组表位多肽的菌体裂解液进行SDS-PAGE，转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂乳4 ℃封闭过夜，加入阳性杂交瘤细胞上清，室温孵育1 h，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，用DAB显色液进行显色。

1.7 McAb的制备、纯化与标记

取6～8周龄雌性BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡，0.5 mL/只，1周后腹腔注射阳性杂交瘤细胞，15万个/只。7～10 d后采集腹水，10 000 r/min离心5 min，上清即为单克隆抗体。将单克隆抗体用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法和DE-52离子交换层析法[14]纯化后，再用改良过碘酸钠法[15]进行HRP标记。

1.8 阻断ELISA方法的建立及最佳工作浓度的确定

1.8.1 阻断ELISA方法的建立

将重组CSFV E2蛋白用PBS稀释至一定浓度包被酶标板，100 μL/孔，4 ℃包被16～24 h。洗涤液洗涤3次，用含20%小牛血清的PBS在37 ℃下封闭2 h，200 μL/孔。洗涤液洗涤3次，每孔加入样品稀释液50μL，空白孔除外。将样品、阳性对照、阴性对照加入酶标板，50 μL/孔，37 ℃反应30 min。洗涤液洗涤5次，HRP标记的单克隆抗体按一定比例稀释后加入，100 μL/孔，空白孔除外，37 ℃反应30 min。洗涤液洗涤5次，加入显色液避光显色15 min。最后加入2 mol/L硫酸终止反应，酶标仪450 nm波长测定吸光值。

1.8.2 最佳工作浓度的确定

将纯化的重组CSFV E2蛋白在横排倍比稀释：1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，酶标单抗在纵排做倍比稀释：1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，用棋盘法确定最佳工作浓度。

1.9 阻断ELISA方法临界值的确定

用1.8建立的阻断ELISA方法检测250份CSFV抗体阳性血清和250份CSFV抗体阴性血清，根据统计学原理，确认该方法的cut-off值。

1.10 阻断 ELISA方法的评价

1.10.1 特异性试验

用建立的阻断ELISA方法对11份特异性样品进行检测，包括BVDV抗体阳性血清、伪狂犬病病毒(PRV)抗体阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体阳性血清、猪细小病毒(PPV)抗体阳性血清、猪圆环病毒2型(PCV-2)抗体阳性血清及6份CSFV抗体阴性血清。

1.10.2 敏感性试验

将免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)效价为1∶12 800的CSFV抗体阳性血清进行一系列稀释，用建立的阻断ELISA方法测定其各稀释度的血清效价。

1.10.3 重复性试验

按建立的阻断ELISA方法，分别进行批内和批间重复性试验：在同一批次的酶标板中，随机取出1块，检测5份CSFV阳性血清和1份CSFV阴性血清，每份样品设置5个复孔；另外，取5块不同批次的酶标板，检测5份CSFV阳性血清和1份CSFV阴性血清，每份样品设置3个复孔。取A值计算每份样品的算术平均值(X)和标准偏差(SD)，求得变异系数SD/X。

1.10.4 应用

用建立的阻断ELISA方法，对已知背景的猪瘟活疫苗免疫猪的系列血清进行检测。

2 结果

2.1 CSFV E2蛋白的表达

重组质粒Bacmid-E2转染sf9细胞，27 ℃培养72 h后，可见细胞出现明显病变，体积增大、细胞内颗粒增多甚至破裂、未形成致密的细胞单层，而正常细胞为大小均一、折光性良好、轮廓清晰、并形成致密的单层细胞。收获感染的sf9细胞上清，即重组杆状病毒，命名为CSFV-E2株。将接种重组杆状病毒的sf9细胞和接种野生型杆状病毒的sf9细胞用冷丙酮固定后，加入CSFV阳性血清进行IFA特异性鉴定，结果接种重组杆状病毒的细胞孔可见明显的绿色荧光(图1A)，野毒感染的细胞对照孔无绿色荧光(图1B)，表明重组CSFV E2蛋白表达成功。

A.感染重组杆状病毒的sf9细胞；B.野毒感染的sf9细胞图1 重组杆状病毒CSFV-E2株接种Sf9细胞IFA鉴定结果

2.2 CSFV E2蛋白的鉴定及纯化

将CSFV E2重组杆状病毒感染后的sf9细胞上清和细胞沉淀分别进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。经HRP标记的鼠抗His单克隆抗体孵育，显色后在sf9细胞上清和细胞裂解后的沉淀中约48 kDa处出现目的条带(图2)。富集细胞上清中的目的蛋白，经不同浓度的咪唑Tris-NaCl(pH值8.0)缓冲液洗脱后电泳(图3)，结果显示当咪唑的浓度为300 mmol/L时，纯化效果最好。

M.蛋白质相对分子质量标准;1.重组杆状病毒CSFV-E2株感染后的sf9细胞上清;2.重组杆状病毒CSFV-E2株感染后的sf9细胞裂解液上清;3.重组杆状病毒CSFV-E2株感染后的sf9细胞裂解液沉淀;4.sf9正常细胞图2 抗His单抗Western blot鉴定重组E2蛋白

1～5.洗脱蛋白的咪唑(pH8.8)浓度为20 mmol/L,30 mmol/L,300 mmol/L,600 mmol/L和1 mol/L;M.蛋白质相对分子质量标准图3 重组E2蛋白经不同浓度咪唑洗脱后的SDS-PAGE

2.3 杂交瘤细胞的制备

细胞融合后经过3次亚克隆筛选出了45株能够稳定分泌抗CSFV E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。取细胞上清进行CSFV阳性血清阻断试验，结果显示4株McAbs具有较高的阻断活性，均不低于85%。

2.4 McAb识别的抗原表位鉴定

将重组表位多肽经原核表达后进行SDS-PAGE，目的条带在28 kDa左右。分别与4株具有较高阻断活性的McAbs 进行Western blot鉴定，结果只有15A9能特异性识别表位多肽，且与对照不反应(图4)，表明15A9识别的表位为能够区分CSFV和BVDV的表位TAVSPTTLR。

M.蛋白质相对分子质量标准;1.对照蛋白;2.重组表位多肽图4 McAb 15A9识别抗原表位的Western blot鉴定结果

2.5 McAb的制备、纯化与标记

选择阳性杂交瘤细胞15A9，利用BALB/c小鼠制备了腹水，经辛酸-饱和硫酸铵沉淀法和DE-52离子交换层析法进行纯化，并通过改良过碘酸钠法进行HRP标记，获得了HRP标记的单克隆抗体。

2.6 阻断ELISA方法的建立

根据棋盘滴定法的结果，确定重组CSFV E2蛋白的包被浓度为2.5 μg/mL，HRP标记的抗体稀释度为1∶8 000。

2.7 阻断ELISA方法临界值的确定

用建立的猪瘟病毒阻断ELISA抗体检测方法检测250份CSFV阳性血清和250份CSFV阴性血清，CSFV阳性血清和阴性血清的阻断率均呈正态分布。以单侧94%的可信度计算本方法的cut-off值，其中阴性血清阻断率平均值为18%，标准差为0.062，其阻断率临界值为30.4%；阳性血清阻断率平均值为63%，标准差为0.117，其阻断率临界值为39.6%。据此，将阻断ELISA方法的cut-off定为：样品阻断率≥40%者为CSFV抗体阳性，样品阻断率≤30%者为CSFV抗体阴性，样品阻断率在30%～40%之间，判为可疑。

2.8 阻断ELISA方法的评价

2.8.1 特异性试验

用建立的阻断ELISA方法检测11份特异性样品，结果均为阴性(表1)，说明建立的检测方法特异性良好。

表1 特异性试验检测结果

2.8.2 敏感性试验

将IPMA效价为1∶12 800的CSFV阳性血清进行梯度稀释，稀释后对应的IPMA效价依次为：1∶6 400，1∶3 200，1∶1 600，1∶800，1∶400，1∶200。当猪瘟抗体IPMA效价为1∶800时，检测结果仍为阳性；当IPMA效价为1∶400和1∶200时，检测结果为阴性(表2)。

表2 敏感性试验检测结果

2.8.3 重复性试验

阻断ELISA方法重复性试验结果显示，批内重复性试验变异系数为2.13%～7.56%，批间重复性试验的变异系数为2.87%～8.49%，均低于10%(表3)，说明该方法的可重复性良好。

表3 批内重复性试验和批间重复性试验结果(OD450)

2.8.4 应用

用自建的阻断ELISA方法检测猪瘟疫苗免疫后0～70 d血清中猪瘟抗体水平，结果显示，最早检出时间为免疫后14 d(图5)。

图5 猪瘟疫苗免疫后ELISA抗体检测结果

3 讨论

猪瘟病毒E2蛋白为位于病毒粒子表面的囊膜糖蛋白，含有4个相对独立的抗原区域(A、B、C、D)，其中位于N端的A、B、C是产生中和抗体的主要区域，含有5个潜在的糖基化位点，而缺少糖基化修饰的E2蛋白不能诱导机体产生中和抗体[17-18]。虽然非糖基化和糖基化的重组CSFV E2蛋白均能和猪瘟病毒抗体反应，但后者结合猪瘟抗体的能力优于前者[18-20]。本研究表达的CSFV E2蛋白的目的分子量为43 kDa，经糖基化修饰后，其分子量大小为48 kDa左右。CSFV E2蛋白的C端有疏水的跨膜区(TMR)，表达含跨膜区的CSFV E2蛋白，虽然可获得与CSFV E2蛋白相同大小的片段，但均为胞内不溶性表达，而表达不含跨膜区的猪瘟病毒E2蛋白，可获得分泌表达的重组蛋白[10,21-22]。本研究选择用含蜂素肽信号肽的杆状病毒载体表达不含跨膜区的猪瘟病毒E2蛋白，虽然有部分CSFV E2蛋白分泌到细胞外，但大部分仍在细胞内，未能有效分泌到细胞外。虽然还不清楚重组猪瘟E2蛋白不能有效分泌到细胞外的原因，但我们分析可能和重组CSFV E2蛋白在细胞内空间折叠有关。将表达重组CSFV E2蛋白的杆状病毒接种sf9细胞的培养物电泳，在细胞裂解液沉淀中除48 kDa目的条带外，还出现35～48 kDa条带，相同情况在其它研究中也有报道，推测可能为重组蛋白在C端发生断裂[10,18]。同时，为检测重组杆状病毒CSFV-E2株接种sf9细胞培养上清存在形式，将经亲和层析纯化的重组CSFV E2蛋白进行分子筛进一步纯化，收集不同峰后进行变性和非变性电泳，结果显示纯化蛋白除单体外，二聚体和多聚体亦存在。

目前对于猪瘟的防治主要依赖于疫苗免疫，ELISA方法以其简便、检测样本量大等优点，多用于疫苗免疫效果的评价。国内研制的间接ELSIA猪瘟抗体检测的方法虽然灵敏性较好，但不易有效鉴别黄病毒科瘟病毒属的其他病毒产生的抗体，且包被的抗原一般为原核表达的E2蛋白，缺少糖基化修饰，与天然构像区别较大，可能会影响反应原性。而国外进口试剂盒价格昂贵，所以开发拥有自主知识产权的产品意义重大。本研究利用E2蛋白制备的McAb 15A9具有阻断活性，识别的表位是能区分CSFV和BVDV的线性表位TAVSPTTLR，且在CSFV不同毒株中高度保守。将重组CSFV E2蛋白作为包被抗原，HRP标记的15A9作为酶标试剂，建立了可以区分CSFV和BVDV的阻断ELISA抗体检测方法，该方法可进行大批量样品检测，且快速、简便，可以用于猪瘟疫苗免疫后猪群抗体的检测，并且可以实现疫苗BVDV污染的鉴别检测。另外，用本方法检测免疫后不同时间猪血清中抗体，最早检出时间为免疫后14 d，免疫后21 d全部转为阳性。本方法检测猪瘟疫苗免疫后抗体转阳时间同Colijn等[23]报道相似，最早检出时间同中和试验相当。有报道称猪瘟疫苗C株免疫后14 d，中和试验检测为阳性[24]，因此可用于疫苗免疫后抗体的检测。

综上，本研究利用杆状病毒表达的重组CSFV E2蛋白，制备了作为于诊断试剂的单克隆抗体，建立了能特异性鉴别CSFV和BVDV的阻断ELISA抗体检测方法，为猪瘟疫苗免疫后抗体的检测及猪瘟疫苗中BVDV污染的鉴别检测提供了重要的技术保障。