钩枝藤抗肿瘤有效部位的制备及活性筛选

陈 静, 李珂珂, 弓晓杰,

(1.大连大学 环境与化学工程学院，辽宁 大连116622;2.大连民族大学 生命科学学院, 辽宁 大连116605)

钩枝藤(Ancistrocladustectorius,A.tectorius)是钩枝藤科(Ancistrocladaceae)钩枝藤属(Ancistrocladus)的一种藤本植物，属内约有20个种，分布于亚、非大陆热带地区[1-3]。中国只有A.tectorius一种，生长于海南岛[4]，在当地作为黎族的民间药物使用，主要用于治疗疟疾、寄生虫感染等疾病[5]。

近年来国内外的研究表明，钩枝藤的提取物或从钩枝藤中分离得到的化合物单体在体外具有良好的抗肿瘤活性。2013年Jiang[6]等从钩枝藤茎和叶的70%乙醇提取物中分离得到 18个萘基异喹啉类生物碱化合物，活性测试发现化合物ancistrotectorine E对HL-60、K562和U937三种人白血病肿瘤细胞系表现出较强的抑制活性，IC50值分别为1.70、4.18和2.56 μM；2015年，蔡彩虹[7]等采用MTT法对钩枝藤的生物活性成分进行了体外研究，发现钩枝藤乙醇提取物对人白血病细胞 K562、胃癌细胞 SGC-7721、肝癌细胞 BEL-7402均具有良好的抑制活性，并与阳性对照紫杉醇的抑制活性相当。

基于上述研究结果，本研究将对中国海南岛所产的钩枝藤，利用人白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7、结肠癌SW-480等5种肿瘤细胞系进行系统的抗肿瘤活性筛选，从而得到有效部位，为进一步单体化合物的分析制备及药物研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

钩枝藤于2018年6月采于海南省昌江县，经大连民族大学弓晓杰教授鉴定，凭证标本(No. 201806)存放于大连民族大学生命科学学院天然产物研究室。肿瘤细胞株HL-60、A549、SMMC-7721、MCF-7和SW-480 细胞均购自中国协和医科大学基础研究所细胞库。

1.2 钩枝藤的提取

钩枝藤茎枝(40 kg)晾干粉碎，用95%乙醇(135 L × 2)在70 °C下回流提取2次，每次2 h，药渣再用70%乙醇在80°C下提取1次，提取液经减压浓缩，得到95%乙醇提取物(GZT-1，2.34 kg)，70%乙醇提取物(GZT-2，1.34 kg)。

1.3 萃 取

将GZT-1用少量水分散溶解，先用环己烷(1L × 6，3次)萃取，收集上清液，得到环己烷层萃取物(GZT-3，38 g)；再用二氯甲烷(1L × 4，

3次)萃取，收集下层萃取液，得到二氯甲烷层(GZT-5，350 g)；余下的浓缩后得到水层(GZT-4，68 g)。

1.4 流份制备

将萃取物GZT-5(300 g)进行二醇基柱色谱闪式层析，采用梯度洗脱，洗脱剂依次为环己烷:二氯甲烷(9:1)、二氯甲烷:乙酸乙酯(20:1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯:甲醇(5:1)及甲醇。每个梯度均洗脱至洗脱液无色，分别收集各个洗脱液，得到5个流份GZT-6、GZT-7、GZT-8、GZT-9、GZT-10。

1.5 有效部位初筛

以人白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及结肠癌SW480 细胞为指示瘤株， 以3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5(3-羧基甲氧基苯基)-2-(4-磺吩基)-2H-四唑鎓(MTS； Promega，中国北京)法测定各个萃取物或流份的细胞毒活性。将处于对数周期的细胞接种到96孔板中(3000～15000个细胞/孔)，每孔100 μL。在37 °C下培养12～24 h后，加入用DMSO溶解的100 μg·mL-1的每种待测样品溶液中，每孔200 μL，每种处理设三组平行试验。在37° C下培养48 h后，每孔添加20 μL MTS溶液和100 μL含10%胎牛血清的培养液(DMEM或RMPI1640)，继续孵育2～4 h，使反应充分进行，在492 nm的波长下测量吸光度，绘制抑制率图。

1.6 有效部位复筛

将处于对数周期的上述5种细胞以每孔100 μL的体积接种到96孔板中(3 000～1 5000个细胞/孔)。在37 °C下培养12～24 h后，加入待测样品，样品均用DMSO溶解，设置100 μg·mL-1、20 μg·mL-1、4 μg·mL-1、0.8 μg·mL-1及0.16 μg·mL-1共5个浓度梯度，每孔终体积200 μL，每种平行处理3份。在37° C下培养48 h后，每孔添加20 μL MTS溶液和100 μL DMEM或RMPI1640培养液，继续孵育2～4 h，使反应充分进行，在492 nm的波长下测量吸光度。以顺铂和紫杉醇(Sigma，St.Louis，MO，USA)作为阳性对照药。用IC50表示每个化合物的细胞毒活性，通过Reed和Muench方法计算IC50值，结果见表1。

表1 钩枝藤样品的细胞毒活性

2 结果与分析

2.1 钩枝藤提取物抗肿瘤有效部位的制备

为了能得到较精准的有效部位，本研究在药材提取及萃取后，对萃取物GZT-5进行了正相色谱的闪式柱层析。根据已有报道，钩枝藤中主要的化学成分为萘基异喹啉类生物碱，此类成分的极性中等偏小，因此首次选用二醇基作为柱层析填料制备得到了5中极性大小不同的钩枝藤流份，为其抗肿瘤有效部位筛选奠定了基础。

2.2 有效部位初筛

以MTS法测定制备得到的钩枝藤GZT-1～GZT-10分别对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及结肠癌SW-480 肿瘤细胞的生长抑制活性，结果如图1。

由图1可知，在100 μg·mL-1浓度下， GZT-1、GZT-5、GZT-7、GZT-8、GZT-9对白血病HL-60、肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7及结肠癌SW-480等细胞均有良好的半数抑制活性； GZT-2对乳腺癌MCF-7细胞具有较好的抑制活性；GZT-3对肺癌A549和乳腺癌MCF-7细胞具有较好的抑制活性； GZT-6对肺癌A549、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW-480细胞具有良好的半数抑制活性； GZT-10对白血病HL-60、乳腺癌MCF-7和结肠癌SW480细胞具有良好的半数抑制活性。根据上述得到的初筛结果，将有针对性地开展进一步的复筛实验，测定其IC50值。

2.3 有效部位复筛

根据上述初筛的实验结果，采用MTS法又分别测定了相关萃取物或流份的IC50值。结果见表1。阳性对照药结果见表2。

表2 阳性对照药的细胞毒活性

由表1和2可知，GZT-3及GZT-6对肺癌A549细胞具有较强的抑制活性及显著的选择性，IC50值分别为2.46、2.77 μg·mL-1，抑制作用分别是阳性药顺铂的7.8倍和7.0倍。对于乳腺癌MCF-7及结肠癌SW-480细胞，GZT-5、GZT-7、 GZT-8及GZT-9都有不同程度的抑制活性，但抑制效果不如GZT-3及GZT-6对肺癌A549的作用强，且没有表现出肿瘤选择性。对于白血病HL-60及肝癌SMMC-7721细胞，所测样品的半数抑制浓度较大，细胞毒活性相对较弱。

3 结 论

随着药学及分子生物学技术在医学研究领域的快速发展，癌症的药物治疗逐渐趋于精准化，靶向药物可以增强对肿瘤细胞的杀伤力，同时减少对正常细胞的毒副作用，已成为癌症药物治疗的研究热点。本研究通过对黎药钩枝藤的提取及色谱分离，采用MTS法测定了不同萃取物及流份的细胞毒活性，结果表明GZT-3及GZT-6对肺癌A549细胞具有显著抑制作用及选择性，提示GZT-3及GZT-6为钩枝藤抗肿瘤的有效部位。基于A549为非小细胞肺癌细胞系，因此，在今后的研究中，可以深入研究此有效部位抗肺癌的作用机制，同时阐明有效部位的活性物质基础，为开发新的非小细胞肺癌药物提供有效来源。