茶多酚类化合物在牙本质粘接中应用的研究进展

刘恩言 李明云

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医学院 成都 610041

在现代口腔修复医学中，微创治疗的理念已经代替了过去Black提出的“扩大预防”的治疗思路。于是符合微创治疗理念的牙体粘接技术经多次改良后，获得了巨大的进步，目前已经广泛用于牙体、牙列缺损修复的领域。虽然牙体粘接修复技术可以满足更为保守的临床治疗要求，同时具有多样化的功能和更简单的临床操作步骤，但粘接界面的稳定性和耐久性却受到一定的限制[1]。

因此，提高牙本质粘接界面的稳定性、耐久性以及预防微渗漏的方法在口腔修复领域得到了广泛的研究。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是茶多酚中的有效活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗糖尿病、消炎、抗癌等作用。有研究显示在牙本质粘接过程中，EGCG的加入有助于提高牙本质与修复体间的粘接效果。

本文就茶多酚类化合物在牙本质粘接过程中发挥的作用以及对应机制作一综述，并探讨未来茶多酚类化合物参与改良牙本质粘接剂研发的临床应用的可能性。

1 牙本质粘接机制

牙本质粘接修复过程的重点是采取更保守的口腔洞形设计，尽可能清除全部龋坏组织。随后利用酸蚀-冲洗技术或者自酸蚀技术进行粘接，最终修复保持的效果主要依赖于粘接材料的粘接效果，如复合树脂、玻璃离子水门汀以及树脂水门汀等粘接材料。

当牙本质因各种因素发生暴露时，牙本质小管中的细胞液在外界的刺激作用下可引起液体向外流动，故牙本质粘接面无法保证完全干燥。牙本质在粘接前均经过切削或打磨，表面产生玷污层，影响粘接的牢固度，常规采用酸蚀技术去除。牙本质表面经酸蚀后，玷污层被去除，其下的牙本质表面也轻度脱矿，牙本质胶原纤维网暴露。在粘接时应保持粘接界面湿润，以防止表面的胶原纤维网塌陷，最终在管间及管周牙本质表面形成一层致密的纤维层[2]。

在润湿的牙本质表面涂亲水性的底涂剂，底涂剂渗入纤维网中。之后，充分吹干牙面，底涂剂中所含的挥发性溶剂带着水分挥发，最终胶原纤维网中充满表面活性单体并保持膨松状态。再涂疏水性的粘接剂，而粘接剂与表面活性单体都是甲基丙烯酸酯类，互溶性强，因而粘接剂也能渗入胶原纤维网中，与纤维网下的牙本质形成紧密的接触，经固化后粘接剂与牙本质胶原纤维网形成一层混合层，从而消除了粘接剂与牙本质之间的界面，极大提高粘接强度[3-4]。

2 茶多酚类化合物对于牙本质粘接效果的影响

随着时间的推移，牙本质-粘接剂形成的黏附界面会发生老化[5]。临床上，修复体失效的主要原因与牙本质混合层裸露胶原水解变性而导致的边缘微渗漏有关，边缘微渗漏可导致修复体边缘变色、发生继发龋和最终的固位丧失，这使得口腔医生需要在相对较短的时间间隔内多次更换修复体。

当前，有大量研究表明天然茶多酚结构中含多个酚羟基，易与牙本质胶原分子形成氢键，从而增强胶原分子的结构稳定性，提高胶原的机械性能及抗酶解能力，从而改善树脂牙本质粘接修复的耐久性[6]。作为天然茶多酚类主要活性物质的EGCG在参与牙本质粘接过程中可以阻止牙本质-粘接剂粘接界面的老化并有效提高粘接界面的生物活性。Kalaiselvam等[7]通过比较3种物质（EGCG、儿茶素以及氯己定）在牙本质自酸蚀和全酸蚀粘接体系中对于即刻与延迟微拉伸粘接强度的影响，结果发现这3种物质可以促进牙本质与树脂粘接剂间形成分子键及氢键，提高牙本质-树脂粘接剂间的键合强度（即化学键的连接强度）值，且三者中EGCG与牙本质的直接结合强度最高。Singh等[8]的研究也证实了使用EGCG预处理牙本质后的6个月内可以维持粘接界面的稳定，并且经过EGCG预处理的牙本质-树脂粘接界面的即刻粘接强度仍保持正常。

然而，如何维持粘接界面长时间有效的药物浓度成为该方向研究的难点。由于存在液体连续流动的牙本质小管结构，缺乏一个有效的、持续较长时间的药物释放源，从而为纳米级药物载体的开发提供了理论依据。纳米级药物载体具有巨大的潜力，可以通过剂量依赖的药物释放维持较长时间的有效药物浓度[9]，其中生物相容性良好以及可降解的聚合物纳米颗粒形成的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid，PLGA）颗粒作为EGCG纳米载体被研究。Albuquerque等[10]的研究发现，将EGCG装载的PLGA颗粒以EGCG：PLGA=1：16的比例加入预处理剂后，显著提高了即刻牙本质的粘接强度，并且在12个月后再次检测发现该实验组的牙本质-树脂键合强度明显高于对照组。该实验证明EGCG在一段时间内有助于维持粘接界面的稳定性，提高粘接剂的耐久性，同时提出了一种新的治疗策略，即通过去矿化牙本质基质的牙本质小管来传递负载EGCG的PLGA纳米颗粒，它可以与树脂突紧密相连，在修复牙本质和粘接系统中具有潜在的应用价值。

与上述实验关注方向略有不同的研究是一些学者[11-12]探究在桩冠修复时使用EGCG作为最终冲洗剂对于根管内牙本质粘接效果的影响，结果显示EGCG作为冲洗剂使用后增加了纤维桩与根尖内牙本质的粘接强度和粘接稳定性。

多项研究结果显示，EGCG除了可以作为预处理剂参与牙本质粘接过程外，还可以直接作为树脂粘接剂的成分，参与粘接黏附的过程，有效维持粘接界面的粘接强度，阻止界面老化，提高粘接剂的耐久性。Yu等[13]在EGCG改性粘接剂方面进行了较多研究，他们探究了EGCG及其甲基化修饰物（EGCG-3Me）改性酸蚀-冲洗粘接剂的粘接强度与稳定性，并与临床常用粘接剂进行对比。结果显示，经过热循环后，对照组的粘接强度明显下降，而加入EGCG/EGCG-3Me的改性粘接剂中微拉伸粘接强度仍保持稳定。Khamverdi等[14]的研究结论表明，添加100 µmol·L-1EGCG加入Clearfil SE粘接剂后可维持粘接界面的粘接强度达6个月，有效防止6个月内粘接剂的老化，但是6个月后牙本质-树脂键合强度随加入的EGCG浓度增加而下降。

综上所述，EGCG既可以作为预处理剂或冲洗剂预先处理牙本质表面，也可以作为牙本质粘接剂的一部分直接参与粘接过程。不论以哪种形式参与粘接过程，均能有效提高牙本质-粘接剂粘接界面的稳定性，在一段时间内阻止牙本质粘接剂发生老化，延长粘接修复体的临床使用寿命。

3 EGCG在牙本质粘接过程中的作用机制

研究表明，牙本质粘接界面的稳定性不能长期保持，粘接界面会随着时间的推移发生退化。导致牙本质粘接界面老化的相关机制研究已经较为明确，主要是几种内源性基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和/或细菌酶被发现参与了胶原原纤维的分解，从而使牙本质粘接界面的混合层受到破坏，降低牙本质粘接界面的稳定性[15]。

近年来，牙本质生物仿生的概念已应用于实现更稳定和持久粘接界面的研究领域中[16]。这涉及到使用一些天然或合成的药物，它们可以作为MMP抑制剂和胶原交联剂，生物修饰并增强牙本质基质[17]的机械性能。各种外源性MMP抑制剂和胶原交联剂已被用作牙本质生物改性剂，它们既可用于牙本质脱矿表面的预处理，也可作为粘接剂的组成成分[14,18]。

EGCG是一种从绿茶中提取的多酚类化合物，含多个酚羟基，易与牙本质胶原分子形成氢键，从而增强胶原分子的结构稳定性。大量研究显示，EGCG是一种天然MMP抑制剂[19-20]，同时EGCG还具有抗菌[21-22]、促进矿化[23]的作用。

现就目前EGCG参与牙本质粘接过程的机制研究进行展开叙述。

3.1 抑制内源性MMP的活性

MMP是一组钙-锌依赖性基质蛋白酶。在人体中，MMP家族中含有23个成员，被分为6组：胶原酶、明胶酶、基质降解酶、基质溶解因子、膜型MMP以及其他MMP（基于底物的特异性和同源性）[24]。目前的研究结果显示，人牙本质中含有MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9及MMP-20共6种。它们存在于钙化的牙本质基质中，在牙本质粘接操作及界面的老化过程中可能被激活，水解失去矿物质保护的牙本质胶原[25]。牙本质粘接获得成功的基础在于树脂粘接剂单体充分渗入脱矿后的牙本质中，形成完整的混合层，从而保证了胶原纤维的稳定。但是，牙本质是一种潮湿、多孔的生物复合体，牙本质小管内的液体易扩散到粘接剂内，使树脂单体渗透不充分，导致混合层底部胶原纤维暴露，同时牙本质源性的MMP缓慢释放，引起胶原纤维的降解。有研究[26]指出，牙本质粘接中的酸蚀过程会暴露牙本质胶原纤维并激活内源性MMP，且活化的MMP使胶原变性降解的效果随着酸蚀时间的延长而更加明显。

在MMP降解Ⅰ型胶原过程中，胶原酶 MMP-1和MMP-8先特异性的将三重螺旋构象的Ⅰ型胶原纤维分解成小肽片段，然后失去典型三螺旋结构的肽片段被明胶酶MMP-2和MMP-9进一步识别，并降解成更细小的肽碎片，同时MMP-9通过分解相对分子质量小的肽键和残余凝胶等Ⅰ型胶原水解后的产物使酶解作用继续进行[26]。由此可见，MMP在Ⅰ型胶原降解中起到至关重要的作用。因此，有学者[27]提出可以应用MMP抑制剂防止混合层中的胶原受到破坏，部分MMP具体的水解胶原作用通路见表1[28-32]。

茶多酚类化合物是一种从茶树中提取的天然MMP抑制剂，EGCG是其中主要的活性物质，它可以抑制MMP-2和MMP-9，改善胶原基质的力学性能，抵抗胶原蛋白降解[17]。一些学者[13,33]的研究结果证实，EGCG可阻止胶原的降解，从而增加受龋损侵犯的牙本质粘接界面的稳定性。还有一些学者[14,34-35]的研究均证实，EGCG可通过抑制MMP的活性，抑制粘接界面胶原以及粘接剂的降解，阻止粘接强度的下降，延长粘接界面的耐久性。

近年来，EGCG对于MMP的作用机制受到关注，许多学者在此方面作出大量研究。Chang等[36]的研究显示，EGCG在无毒水平上可以通过抑制ERK1/2磷酸来下调分泌的MMP-2的活性，从而抑制黑色素瘤细胞的迁移。Li等[37]在研究动脉粥样硬化的过程中发现EGCG通过抑制Toll样受体4（Toll-like receptors 4，TLR4）/MAPK/NF-κB信号通路，减少动脉粥样硬化斑块中细胞因子的表达，从而下调MMP-9及单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）的水平，提出EGCG未来可能是有效的稳定动脉粥样硬化斑块的天然药物。Ho等[38]在研究中证实，EGCG可以通过调节Src信号通路下调MMP-2蛋白的表达，从而抑制人鼻咽癌细胞的转移活性，提示EGCG可能是鼻咽癌化学预防的潜在候选药物。Sarkar等[39]的研究显示，EGCG通过抑制细胞膜上烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶组分p47phox和p67phox的结合，抑制NADPH氧化酶活性，减弱内皮素-1（endothelin-1，ET-1）诱导的MMP-2的活化。

表1 MMP降解牙本质胶原的分子机制Tab 1 Molecular mechanism of MMP degradation of dentin collagen

当前，EGCG在牙本质粘接系统中对于Ⅰ型胶原的具体作用机制仍不明确，需要研究人员在此方面作出更加深入的探索。

3.2 提高胶原的机械性能

天然多酚结构中含多个酚羟基，易与胶原分子形成氢键，外源增加胶原分子间氢键，从而增强胶原分子的结构稳定性。此外，儿茶素稳定胶原的机制研究亦证实天然多酚与胶原间的疏水作用是稳定胶原结构的主要力量[40]。

3.3 增强胶原的抗酶解性能

研究[41]显示，经化学物质改性后的胶原组织能较好维持固有形态尺寸，显著减缓胶原水解速率。这可能与化学改性后胶原间交联度增加有关[6]。胶原分子间交联度的提高，可致蛋白酶与胶原结合位点间形成空间阻隔，从而阻碍酶和底物的相互作用。目前，有关EGCG增强牙本质胶原抗酶解的研究较少，希望未来相关领域的研究人员在此方向继续深入探索。

4 展望

改进的粘接技术已经广泛地影响了现代口腔修复治疗的概念。为了简化粘接技术，研究人员减少了完成粘接程序所需的步骤，自酸蚀粘接剂应运而生，并开始广泛使用。然而，此种粘接剂更容易被水吸附，与多步骤粘接剂相比，其更容易发生粘接降解，而且容易过早失效。因此，牙本质-粘接剂界面的不稳定性是导致修复体失效的重要原因之一，界面不稳定的主要原因是MMP诱导的牙本质胶原降解。近年相关的研究主要集中在开发具有较好粘接稳定性的牙本质粘接剂体系[42-45]，但相关机制研究以及临床试验较少，仍有待研究者们在上述方向进行探究。同时，还有一些学者提出了牙本质粘接体系的创新治疗方式，如Albuquerque等[10]的实验采用EGCG与PLGA颗粒作为控释系统，提出了牙本质粘接控释新概念；还有研究者[46]发现，0.02% EGCG/乙醇溶液预处理能有效提高酸蚀漂白后的牙本质的粘接强度和粘接稳定性。目前，粘接剂面临微创修复理念带来的保守治疗预备的洞形导致粘接界面不稳定以及粘接剂溶解造成的粘接耐久性较差的问题，而这些研究结果极有可能在未来解决当前面临的问题，从而促进牙本质粘接剂的发展。