Snail基因及E-cadherin蛋白在贲门癌的表达及其临床意义

李纪远 马 新 张灿斌 王 献 郑帅玉 王 强

河南科技大学第一附属医院胸外科，河南省洛阳市 471000

近二十年来，世界各地特别是美国、日本、中国和欧洲等国家胃远侧部位肿瘤发生率呈显著下降趋势，而贲门癌发病率却呈明显上升趋势, 贲门癌发病隐蔽，分化程度低，侵袭性强，浸润范围广泛，贲门癌的5年生存率只有20%～30%[1]，对人类健康威胁很大。大量的研究数据表明，贲门癌的浸润、转移是其主要的致死原因， 因此对其浸润和转移等临床病理特征的研究很有意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集河南科技大学第一附属医院病理科2011—2013年间贲门癌切除标本136例，患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗，均经病理证实为腺癌。其中男86例，女50例；年龄32～73岁，中位年龄56岁。术后病理检查有淋巴结转移75例，无淋巴结转移61例；高分化24例，中分化26例，低分化86例。以42例癌旁组织为参照物。

1.2 主要试剂 Snail多克隆抗体购自Abcom公司(17732)，E-cadherin多克隆抗体(ZM0092)、免疫组化SP试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉生物技术有限公司，柠檬酸盐抗原修复液购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 载玻片的处理：将载玻片用洗涤液浸泡，清洗干净后，过两遍蒸馏水，晾干。再放入泡洗液(浓硫酸250ml，重铬酸钾100g，蒸馏水750ml)中，浸泡24h，取出载玻片，流水冲洗干净，烘干箱内烤干载玻片。涂防脱片剂多聚赖氨酸，涂片范围占载玻片的2/3，自然晾干备用。

1.3.2 组织标本的取材和固定：手术切除标本，取肿瘤组织约2cm×1.5cm×0.3cm大小，常规固定，石蜡包埋。

1.3.3 切片：连续切片，展开后捞片，置烤箱中70℃烤片3h。

1.3.4 免疫组织化学染色步骤：S-P试剂盒原理：采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化酶及底物色素混合液来测定细胞和组织切片中的抗原。染色的主要过程如下：(1)蜡切片常规脱蜡和水化。(2)每张切片滴加1滴3 %过氧化氢溶液(试剂A)，灭活内源性过氧化酶活性。(3)用PBS(pH 7.4)冲洗3次，3min/次。(4)高温高压组织抗原修复。(5)每张切片滴加1滴的非免疫动物血清(试剂B)，室温孵育10min。(6)甩去血清，每张切片滴加1滴一抗体，4℃过夜。(7)用PBS(pH 7.4)冲洗3次，3min/次。(8)每张切片滴加1滴或50μl的生物素标记的二抗工作液(试剂C)，37℃温箱孵育30min。(9)用PBS(pH 7.4)冲洗3次，3min/次。(10)每张切片滴加1滴链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液(试剂D)，37℃温箱孵育30min。过氧化物酶使底物发生反应，于反应部位产生棕黄色沉淀物。(11)用PBS(pH 7.4)冲洗3次，3min/次。(12)每张切片滴加2滴新鲜配制的DAB，显色3～10min。(13)冲洗，复染，分化，返蓝，脱水，透明，封片。

1.4 结果判定 Snail阳性结果判定标准：以胞核出现棕黄色染色为阳性细胞，按染色强度的深浅积分，0分：无染色，1分：弱阳性，2分：强阳性。按着色细胞百分比，1分：1%～25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：76%～100%。然后按照阳性细胞×染色强弱计积分，积分1～2为阴性，积分3～8为阳性。E-cadherin阳性结果判定标准：以胞膜和(或)胞质出现棕黄色染色为阳性细胞，每例切片选择高倍视野(×100),按阳性细胞数占视野中总细胞数的百分比分为阳性与阴性：无阳性着色或阳性细胞数<25%为阴性，阳性细胞数≥25%为阳性。

1.5 统计学方法 所得数据应用SPSS13.0软件进行统计学处理。计数资料以(%)表示，比较采用χ2检验，表达相关性用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Snail、E-cadherin贲门癌组织及癌旁组织中的表达 136例贲门癌组织Snail阳性率72.8%,高于癌旁组织42.9%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。Snail在癌旁组织中的表达主要见于轻中度不典型增生上皮，贲门癌组织E-cadherin的阳性率36.7%，显著低于癌旁组织85.7%，两者比较差异有统计学意义P<0.05)。见表1。

表1 贲门癌及癌旁组织中Snail蛋白及E-cadherin蛋白的表达

2.2 Snail与E-cadherin的表达与贲门癌浸润、转移以及不同分化程度的关系 侵及黏膜层组Snail的阳性表达率为29.4%，侵及肌层以上组Snail的阳性表达率为62.7%，两者比较差异有统计学意义(P=0.02)。有淋巴结转移组Snail在贲门癌的阳性表达率为66.7%，高于无淋巴结转移组Snail在贲门癌的阳性表达率32.8%，两者比较差异有统计学意义(P=0.03)，侵及黏膜层组E-cadherin的阳性表达率为79.4%，侵及肌层以上组E-cadherin的阳性表达率为52.0%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)。有淋巴结转移组E-cadherin在贲门癌的阳性表达率为49.3%，明显低于无淋巴结转移组Snail在贲门癌的阳性表达率77.1%，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，Snail的阳性表达率随肿瘤分化程度的降低而升高，低分化组阳性率显著高于高、中分化组(P<0.05)；E-cadherin在贲门癌中的表达随肿瘤分化程度的降低而降低，高、中分化组阳性率相比较差异无统计学意义(P>0.05)，但阳性表达率明显高于低分化组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 贲门癌组织中Snail蛋白表达与临床病理学特征的关系

2.3 贲门癌组织中Snail与E-cadherin表达的关系 经Spearman等级相关分析示，随着E-cadherin阳性表达减弱，Snail的阳性表达明显增高，两者在贲门癌中的表达呈负相关(r<0,P<0.05)。见表3。

表3 贲门癌组织中Snail与E-cadherin表达之间的关系

3 讨论

E-cadherin又称为L-CAM、CAM120/80、Arc-1，其基因位于人16号染色体长臂16q22.1上，表达产物是一种相对分子质量为120×103的Ca2+依赖性跨膜糖蛋白。上皮钙黏附素E-cadherin普遍存在于各类上皮细胞，介导同型细胞连接，在维持正常上皮细胞形态、细胞极性及组织结构完整性中发挥重要作用[2]，E-cadherin介导的黏附系统的破坏，是肿瘤从非浸润性转化为浸润性的关键步骤[3]。 E-cadherin减少、丧失，以及异质性、非极性分布使细胞间黏附力减弱，导致肿瘤细胞易于脱离原发灶而侵入到周围组织和血管，继而进行扩散。Kremer等[4]发现转染野生型E-cadherin的瘤细胞生长较对照细胞慢，且肿瘤转移灶中E-cadherin表达完全丧失。大多数实验表明，人体恶性肿瘤细胞中E-cadherin常呈低表达。Sloan等[5]及Cheng等[6]报道E-cadherin低表达显著与食管癌浸润、转移有关。这与本实验结果基本一致。这些研究证实E-cadherin的功能明显影响细胞的生物学行为，在贲门癌的浸润转移中可能起重要作用，并认为是判断贲门癌预后的一个重要指标。

Snail是一类锌指转录因子，近年来发现它的高表达与许多肿瘤的发生发展有关而备受关注，E-cadherin被认为是Snail的直接作用靶基因，转录因子Snail可与上皮钙黏附因子E-cadherin启动子区E-盒结合从而抑制E-cadherin的转录[7]，引起E-cadherin表达降低或缺损，从而导致上皮间连接的破坏。本实验表明，Snail高表达于贲门癌组织中，并与浸润转移的发生有关。同时也证实了Snail的高表达与E-cadherin的低表达呈负相关，这在很多上皮性肿瘤(包括鳞癌、肝癌、黑色素瘤等)[8-9]中也明显存在反向表达。

在某些胚胎发育期起重要作用的基因常常在癌组织中被发现，提示它们可能参与一些启动肿瘤发生和促进肿瘤转移的关键步骤， 其中Snail家族成员在此过程中发挥着主要作用。也就是说，在胚胎发育中Snail在上皮细胞—间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)中的作用被回忆。即Snail通过下调E-cadherin的表达进而诱导发生EMT，EMT与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系。笔者认为，Snail使E-cadherin的表达下调，使肿瘤细胞失去黏附，从原发灶脱落分离，且与上皮性肿瘤进展过程中触发EMT，即级联反应的第一步有关。从而向局部浸润、向淋巴结或远处转移。因此，Snail与E-cadherin的联合检测可作为上皮性肿瘤恶性程度及预后的参考指标，联合检测Snail和E-cadherin对预测贲门癌浸润转移有重要意义。Snail高表达和E-cadherin低表达可能是贲门黏膜恶性转变及发生浸润转移的重要生物学标志。Snail和E-cadherin的表达与分化程度、临床病理分期存在相关性，可作为判断食管癌进展的重要标志之一。从肿瘤发生的观点来看，这不仅对理解肿瘤的发生和转移是重要的，同时又能充当转移潜能的标志物，将会促进对肿瘤的个性化治疗的规划。当然，在非侵袭性肿瘤向侵袭性肿瘤发展过程存在着复杂的调控机制，并且仍有许多问题不甚明确，这些复杂的机制需要我们进一步去深入的探讨和研究，希望能够为上皮性肿瘤的诊断治疗提供更有利的理论依据，这也势必成为肿瘤侵袭、转移机制研究的新热点。