雪里蕻对于Cd、Zn的耐性及富集特性研究

郭堤，管伟豆，张洋，刘翔宇，李一曼，张增强*

（1.西北工业大学生态环境学院，西安710129；2.西北农林科技大学资源环境学院，陕西 杨凌712100；3.西安市固体废弃物处置中心，西安710038）

在众多的重金属污染土壤修复技术中，植物提取由于其绿色环保性及实用性，自20 世纪80 年代以来就出现在公众视野中[1]。植物提取技术的关键是寻找到合适的、能高效吸收重金属的植物，即超富集植物。由于植物提取技术主要依靠超富集植物对重金属污染土壤进行修复，所以植物生长状况、对环境的适应性和对重金属的吸收等成为植物修复技术效率的关键因素[2]。然而，自然界中符合该条件的超富集植物种类相当有限。因此，众多科研工作者将工作重心放在超/高富集植物品种筛选方面[3-4]。

修复植物的生物量和重金属富集转运能力直接决定了植物中金属提取量的大小和植物提取的效率。另外，修复植物对于重金属的解毒能力和耐受性也能够显著影响植物生长的状况，从而影响其生物量的大小。重金属能够诱发植物一系列生化、形态变化和生理紊乱。超富集植物在重金属污染土壤中采取不同的策略以避免细胞损伤，维持生长。植物所采用的耐受机制之一是通过各种抗氧化酶对抗活性氧的增加，这些酶包括过氧化氢酶、多酚氧化酶、超氧化物歧化酶和过氧化物酶等[5]。因此，修复植物的重金属耐受性和解毒能力亦是植物提取技术的关键。由于超/高富集植物种植的地域差异性，围绕矿山开采及金属冶炼厂周边筛选优势先锋植物进行场地植被恢复和污染修复是经济可行的，且相比其他超/高富集植物适宜性更强。近年来，国内学者在矿山及冶炼厂废弃场地生态修复方面取得了一些新的进展。例如，黄建洪等[6]发现羽序灯心草具有较强的恶劣环境适应性及Zn/Cu 耐受性，具有较大的修复酸性矿山废弃场地的潜力。叶文玲等[7]的研究结果表明苏槐蓝、续断菊、苦卖菜和巢菜可作为耐性植物，应用于重金属含量比较高的尾矿区修复。薛清泼等[8]指出可选用苜蓿修复铀矿污染土壤中的U和Cd。

我想：重点在心意，只要味道好就可以了。之后，我先往锅里倒一些油，等油微热便把肉倒进了锅里，一下子，热油像发怒了似的全都溅了出来。我非常害怕，飞一般地跑开，等油不再四处飞溅了，再跑回去。这时，肥肉正好有些微黄，根据爸爸的指导，我将煤气调到小火，往锅中倒入酱油、料酒，撒入少许的糖，翻炒几下后加入了一碗水，使水刚刚没过肉。再调到大火，沸腾约七分钟后，复调成小火炖了一个多小时，爸爸掀开锅盖，看了一眼后，对我说：“儿子，准备收汁！”我赶紧调大火收汁。眼前一块块五花肉油亮亮的，香气扑鼻，实在太诱人了！

十字花科的许多种类植物由于生长速度快、产量较高、易于收获等优点已经作为植物修复候选者被广泛报道。雪里蕻（Brassica juncea，Coss），又名雪里红，隶属于十字花科、芸苔属，是我们常见的蔬菜之一。本课题组于2012—2015 年对陕西凤县某锌冶炼厂（33°56′45.5″N，106°31′53.5″E）周边65 种植物（分属28 科、56 属）的生物量、重金属富集转运能力和耐受性进行了分析。雪里蕻从众多植物中脱颖而出，其对Cd 和Zn 有较好的富集和耐受能力，在修复Cd、Zn 污染土壤方面具有很大的应用潜力[9]。然而，在试验条件可控情况下，基于雪里蕻作为修复植物的目的，关于其对Cd、Zn 耐受性和富集转运能力的系统研究还未曾报道。因此，本研究着眼于探讨供试植物雪里蕻在不同培养方式（土培和砂培）下对于重金属Cd、Zn的富集转运能力及雪里蕻生长状况和生理响应，以期为雪里蕻修复农业Cd、Zn 污染场地提供基础理论依据，为土壤重金属植物修复技术提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用污染土壤采自陕西省凤县某锌冶炼厂附近的农田，干净土壤采自距该锌冶炼厂上风向10 km左右的农田，取样深度为0～20 cm。采集的土壤去除大颗粒石块和植物残骸，风干后过2 mm尼龙网筛。供试土壤基本理化性质如表1所示。

该方案的缺点为：地铁车站被一分为二，对客流组织、运营管理、设备布置以及消防疏散提出了更高要求；乘客使用不方便，运营管理人员、费用将增加；车站与高架桥总宽度约46 m，占用地下空间资源较大；施工过程中增加了两排围护墙，工程造价有一定的增加。

取121 ℃下灭菌30 min、直径9 cm 的培养皿作为种子发芽皿床，在每个培养皿中放置两张与皿同大小的无菌滤纸。按照设计处理，在相应的皿床中加入10 mL 的蒸馏水（对照组）或重金属溶液，设计浓度如表5 所示。选大小一致的雪里蕻种子30 粒，经5%NaClO 溶液消毒后用蒸馏水冲洗干净，并浸种6 h，然后均匀置于准备好的滤纸皿床中，盖上皿盖，在28 ℃培养箱中进行培养，每天以称质量法添加蒸馏水保持皿床的湿度，一周之内观察种子的萌发情况（以胚芽或胚根突破种皮者计为萌发）[10]。

群众就业问题。涠洲岛旅游产品开发程度较低，同质化现象突出，休闲度假产品较少，没有形成具有涠洲岛地方特点和清晰明确的旅游产品体系。仍以旅游观光产品为主，游客当天往返，刺激岛上经济发展和带动岛内居民就业及收入提高的作用不强。

砂培试验所用Hoagland 营养液配方如表2 所示。配制全营养液时，取A液、B液各10 mL、C液与铁盐溶液各1 mL 进行混合，然后稀释至1 L，即得理论浓度的Hoagland 营养液。Cd、Zn 复合重金属溶液中Cd、Zn 的来源分别为CdCl2、ZnCl2（分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。分别称取CdCl2、ZnCl2溶于蒸馏水中，制成100 mg·L-1和1 000 mg·L-1的Cd/Zn 储备液，储存于4 ℃冰箱中，使用时按设计浓度进行稀释。

1.2 不同培养方式下雪里蕻Cd、Zn耐性及富集特性试验

过氧化氢酶（CAT）是一种存在于生物体内的金属酶，可将对生物体有害的H2O2分解为H2O 和O2。由图4C 可看出，砂培下雪里蕻植株内CAT 活性随着Cd、Zn 浓度的不断增高而逐渐降低，并在S4 处理时达到最低值15.0 U·g-1FW·min-1。Feng 等[29]研究表明，当植物中的重金属含量达到一定浓度时，CAT 活性会受到抑制。Chen等[30]表示，CAT活性取决于植物受重金属胁迫的程度。朱成豪等[25]发现当Cd、Zn 浓度尤其是Cd 浓度持续增加到一定程度时，麻疯树植株受到毒害作用而产生的过量O-2会使CAT 氧化压力增大，失去调节平衡，催化H2O2分解的能力减弱，植物细胞可能发生膜脂过氧化，CAT活性降低。

土培试验在西北农林科技大学资源环境学院旱棚中进行。试验共设置5个处理，每个处理重复3次，共计15盆。采用圆形塑料盆（高12 cm、直径20 cm），将已风干的供试土壤过孔径2 mm 尼龙筛后装盆，每盆3 kg，再分别加入N 0.3 g·kg-1、P 0.2 g·kg-1和K 0.3 g·kg-1（来源分别为尿素、磷酸二氢钠和氯化钾，分析纯）作为底肥。每盆播种经5% NaClO 消毒的雪里蕻种子20 粒，待幼苗长出真叶后，间苗为5 株。每天给盆栽添加自来水（未检测出Cd、Zn），维持土壤田间持水量的70%。经55 d的生长期，将成熟植物的茎叶和根系分别用自来水冲洗后再用去离子水洗净，装入信封105 ℃下杀青30 min，然后在70 ℃下烘至恒质量，称量干物质质量，研磨过20目筛，密封保存[5]。另外，采集盆栽土100 g左右，自然风干，分别过100目和20目筛，用于测定土壤的理化性质和重金属含量。试验处理设计见表3。

若要满足H(m,n)的点可区别边染色,需引入种颜色对一些边的颜色重新作调整,首先将边u11u12染为k+2色,u0(2n+2)u1(2n+1)染为k+1色,um2um3染为色；其次,把边us(2n+1)us(2n+2)(s=1,3,…,m-1)染为色,把边us1us2(s=3,5,…,m-1)染为色。

表1 土壤部分基本理化性质Table 1 Physical and chemical properties of the soil

表2 Hoagland营养液配方Table 2 The recipe of nutrient solution for potherb mustard

1.2.2 砂培试验

砂培试验设置5个处理，每个处理重复3次，共计15 盆。砂培杯中采用20 目石英砂为基质（石英砂经过泡酸和水洗处理去除重金属）。选大小一致的雪里蕻种子20 粒，经5% NaClO 消毒、蒸馏水浸种后播种于砂培杯中，并在表面覆盖60～100 目石英砂少许，以减少水分散失。砂培杯放置于人工气候室，白天温度25 ℃，光照16 h；晚上温度18 ℃，黑暗8 h。每天称质量法交替补充1/2 Hoagland 营养液或设计浓度的Cd/Zn 复合溶液，观察雪里蕻出苗和幼苗生长情况，待长出真叶后，每盆间苗为3 株[10]。经55 d 的生长期，将成熟植物的茎叶和根系分别用自来水冲洗后再用去离子水洗净，取1 g左右茎叶鲜样于3 d内测定雪里蕻生理生化指标，其余样品装入信封105 ℃下杀青30 min，然后在70 ℃下烘至恒质量，称量干物质质量，研磨过20 目筛，密封保存。综合考虑前人研究[2，10]并结合先前雪里蕻砂培预试验的生长状况，本试验处理设计如表4。

表3 土培试验设计Table 3 Experimental design of soil culture experiment

1.3 Cd、Zn胁迫下雪里蕻种子萌发试验

雪里蕻种子购自安徽省淮南市玉良种子公司，发芽率≥85%。

表4 砂培试验设计Table 4 Experimental design of sand culture

表5 种子萌发试验设计Table 5 Experimental design of seed germination

统计发芽试验第4 d 雪里蕻种子的发芽率，即为发芽势。

粉彩花鸟瓷绘画中粉彩清雅的釉色与瓷器莹润的玻璃白的结合与国画中花鸟作品的线条和清雅的色彩有着异曲同工之妙。

统计发芽试验第7 d 雪里蕻种子的发芽率，即为发芽率。

1.4 指标的测定

取0.500 g 新鲜雪里蕻叶片剪成0.2 cm 左右的小块，在研钵中加入0.1 mol·L-1pH 7.0 的磷酸缓冲液（Na2HPO4-KH2PO4）进行冰浴研磨（加入少量石英砂）。待磨成匀浆后，将其转移至10 mL 离心管中，在4 ℃下10 000 r·min-1离心15 min，然后用定性滤纸进行过滤，得到的过滤液即为粗酶液。测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）时，取1 mL 粗酶液于10 mL具塞试管中，加入5 mL 0.5% 硫代巴比妥酸溶液，摇匀。将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管出现小气泡开始计时），随后立即取出并放入冷水浴中冷却至室温。将该溶液在3 000 r·min-1下离心15 min，取上清液分别于532、600、450 nm 下测定吸光度，计算公式见公式（3），式中Vt和Vs分别为测定时取用粗酶液的体积和粗酶液的定容体积，单位均为mL。

称取0.500 g 充分烘干、磨碎的植物样品于100 mL 锥形瓶中，加入10 mL HNO3-HClO4（3∶1）混酸，置于不断升温的电热板上消解。在消解过程中，不断补充HNO3溶液以防止煮干。待溶液消解至无色透明，将最终溶液在室温下定容至50 mL，经过滤后，用火焰原子分光光度计（Z-5000，日立，日本）测定溶液中Cd、Zn的含量[11]。

1.4.2 丙二醛及植物酶的含量

1.4.1 植物中Cd、Zn的含量

传统的通过径向振动信号诊断转轴裂纹的方法中，最有效的就是监测对比转子过1/2、1/3等临界转速时的1、2、3倍频信号幅值改变程度和观察对比转子临界转速的改变量，也就是轴裂纹的径向振动信号特征，只有在机组启停机转子升降速时才有明显的表现，但是石化等流程企业中运行的大型机组，通常运行周期多在一年以上，中途不会为了检查转子裂纹而做停机升降速试验，这样对企业来说少则是几百万元、多则是数千万元的损失，而转子轴的裂纹从生成到扩展断裂，时间就短得多，因此就需要有一个新的方法，在转速变化不大的正常运转中，监测诊断转子轴裂纹的生成与扩展。

植物叶片中多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）、过氧化氢酶（Catalase，CAT）和叶绿素含量根据Guo 等[5]的方法利用紫外分光光度计（UVmini-1240，岛津，日本）进行吸收测定。可溶性蛋白的测定遵照Zheng 等[12]的方法：取植物提取液0.2 mL，加入0.9 mL 蒸馏水和5 mL考马斯亮蓝G-250 试剂，充分混合，放置2 min 后在595 nm下比色。

1.4.3 土壤中Cd、Zn的含量

称取0.500 g 过100 目筛（0.149 mm）的土壤于100 mL 锥形瓶中，加入10 mL HCl-HNO3-HClO4混酸（V/V/V，5∶5∶1），放置过夜。次日，将锥形瓶置于电热板上190 ℃消解，过程中补充HNO3溶液以防止烧干。待土壤消解至灰白色，取下锥形瓶冷却至室温。用蒸馏水定容至50 mL，定性滤纸过滤。滤液用火焰原子吸收分光光度计测定溶液中Cd、Zn的含量，即为全量Cd、Zn[13]。

1.5 植物提取指数计算

植物重金属耐性系数（Tolerance index，TI）和植物提取指数，即生物富集系数（Biological concentration factor，BCF）、转运系数（Translocation factor，TF）和金属提取量（Metal extraction factor，MEA）计算公式[5]分别为：

植物生理代谢活动中，在叶绿体中进行的光合作用是一重要反应。单位质量植物叶绿素的含量可以用来表示植物光合作用的强弱，从而指示植物的生理活性[20]。由图3可知，随着Cd、Zn浓度的增大，土培和砂培雪里蕻的叶绿素含量均呈不断下降趋势，这与刘亮[21]和李元等[22]研究结果一致，表明Cd会降低雪里蕻叶绿素含量，抑制雪里蕻光合作用。这可能是由于Cd 抑制了与叶绿素前体合成相关酶的作用，导致叶绿素分解，破坏了叶绿体微结构[23]。Zn参与植物叶绿素的形成，但当Zn 浓度超过一定临界值后会对植物产生毒害作用，减弱植物光合作用，抑制植物的生长[