壳聚糖对平菇褐斑病病原菌的抑制作用及机理*

刘 芹，宋志波，崔 筱，孔维丽，胡素娟，袁瑞奇，张 燕，康源春

（河南省农业科学院植物营养与资源环境研究所，河南 郑州 450002）

平菇（Pleurotus ostreatus）在分类学上属担子菌门（Basidiomycota）层菌纲（Hymenomycetes）伞菌目（Agaricales）侧耳科（Pleurotaceae）侧耳属（Pleurotus）[1]。平菇子实体营养丰富、肉质肥厚、味道鲜美，具有很高的营养价值，是全球范围内栽培面积最广的食用菌之一[2]。平菇具有较好的医疗保健作用，经常食用可提高人体免疫力，降血压，降低血液中的胆固醇含量；对肝炎、胃溃疡、心血管疾病、糖尿病也有一定的预防和治疗作用[3-5]。平菇褐斑病（brown bloth disease）俗称斑点病、锈斑病、黄斑病，是平菇栽培中较为常见的一种细菌性病害，对平菇生长发育具有极大的危害[6]。平菇褐斑病的病原菌为托拉斯假单胞杆菌（Pseudomonas tolaasii），该细菌产生的托拉斯毒素（tolaasin）通过与平菇菌丝细胞膜相互作用，导致菌丝破裂，最终使得平菇菌盖表面产生黄褐色或深褐色的斑点，严重影响平菇子实体的商品价值，降低菇农的经济效益[7]。目前对平菇褐斑病的防治多采用化学手段，但长期使用化学试剂在杀死细菌的同时会造成药物残留，对人体健康产生危害[7-8]。壳聚糖（chitosan）是一类含有N-乙酰-D-β(1→4)葡萄糖结构单元的多糖，具有天然无毒、良好抑菌性等优点[9-10]。因此，通过开展壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌抑制作用研究，并对其抑菌机理进行初步探索，为平菇褐斑病的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

托拉斯假单胞杆菌（JCM21853）购自日本微生物菌种保藏中心，现保藏于河南省农业科学院食用菌研究开发中心。

1.1.2 主要试剂与仪器设备

Luria-Bertani（LB）液体培养基和平板计数琼脂培养基（PCA），海博生物技术有限公司；食品级壳聚糖，青岛弘海生物技术有限公司；分析纯氯化镁（MgCl2）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）、茜素红、氢氧化钠、氯化钠、乙酸钠（NaAc）和乙酸（HAc），天津市凯通化学试剂有限公司；丙二醛（MDA）、碱性磷酸酶和总蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所。

LRH-325A生化培养箱，广州泰宏君科学仪器股份有限公司；Blue Star A紫外可见分光光度计，北京莱伯泰科股份有限公司；LE204E/02电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；GT10-1高速离心机，上海精科天美科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 病原菌悬液制备

在LB液体培养基中接入已活化托拉斯假单胞杆菌单菌落，28℃恒温震荡培养12 h。采用分光光度计在波长600 nm条件下检测病原菌菌体密度，吸光值为0.8时，得到浓度约为1×108CFU·mL-1的供试菌液[11]。

1.2.2 MIC和MBC的测定

壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定采用梯度倍比稀释法并加以改进[12-13]。采用体积分数为0.5%的HAc溶液配制不同浓度的壳聚糖溶液，后用1 mol·L-1NaOH将 HAc溶液 pH调至 5.6用于后续试验。在2倍LB液体培养基（50 mL）中分别加入同体积壳聚糖溶液，使其终浓度分别为0.06 mg·mL-1、0.13 mg·mL-1、0.25 mg·mL-1、0.50 mg·mL-1、1.00 mg·mL-1、2.00 mg·mL-1、4.00 mg·mL-1及8.00 mg·mL-1，对照组培养基加入等体积0.5% HAc溶液，121℃高温灭菌30 min。接入10 μL供试菌液（终浓度约为1×104CFU·mL-1），充分混匀，于28℃震荡培养箱中培养24 h，用梯度稀释法计数，以无明显细菌生长的最小壳聚糖浓度为MIC值。将上述结果细菌无明显生长的各浓度管分别取500 μL液体涂布于平板计数培养基，28℃倒置培养24 h，将培养皿中无明显菌落生长的最小壳聚糖浓度定义为MBC值[14]。

1.2.3 时间对抑菌活性的影响

分别配制壳聚糖浓度为MIC、2倍MIC及4倍MIC的LB液体培养基，对照组培养基加入同体积0.5% HAc溶液，充分灭菌后，接入10 μL供试菌液（终浓度约为1×104CFU·mL-1），28℃，128 r·min-1恒温震荡培养，分别于0、1 h、3 h、6 h、12 h和24 h时，各取100 μL菌液进行平板计数，并绘制菌落数和时间的关系曲线[12]。

1.2.4 壳聚糖对细菌细胞壁完整性的影响

取浓度约为 1×108CFU·mL-1的供试菌液 1 mL，4 000 r·min-1离心10 min，沉淀用生理盐水冲洗2次后重新悬浮并调整OD600为0.6[11]。将3种浓度MIC壳聚糖溶液分别与供试菌液同体积混匀，对照组加HAc溶液，于上述培养条件分别处理0、3 h、6 h、9 h、12 h 和 24 h 后，4 000 r·min-1离心 10 min，取上清液检测碱性磷酸酶的含量。

1.2.5 壳聚糖对细菌细胞膜完整性的影响

托拉斯假单胞杆菌处理步骤如1.2.4所示，将3种MIC浓度壳聚糖溶液分别与供试菌液同体积混匀，对照组加HAc溶液，于上述培养条件分别处理0、2 h、4 h、6 h和8 h后，采用紫外分光光度计测定上清液在260 nm及280 nm处的吸光值[12，15]。

1.2.6 壳聚糖对细菌细胞膜通透性的影响

取浓度约为 1×108CFU·mL-1的供试菌液 1 mL，4 000 r·min-1离心 10 min，沉淀用 Na2HPO4（10 mmol·L-1）、MgCl2（5 mmol·L-1，pH 7.0）配制的混合液冲洗2次后，重新悬浮并调整OD600为0.6[11]。将3种浓度壳聚糖溶液分别与供试菌液同体积混匀，对照组加HAc溶液，28℃，128 r·min-1恒温震荡培养30 min后，10 000 r·min-1离心10 min，取上清200 μL用Na2HPO4-MgCl2溶液稀释10倍，作为待测溶液。取1 mL茜素红溶液（3.33×104mol·L-1），1 mL NaAc-HAc缓冲液（pH 5.0）及1 mL待测溶液，混匀后测定422 nm处吸光值[9，15]。托拉斯假单胞杆菌对壳聚糖的吸收量（y，mg·mL-1）公式为：

式中：x为422 nm处测定吸光值。

1.2.7 壳聚糖对细菌MDA和胞外蛋白质含量的影响

使用3种MIC浓度壳聚糖LB液体培养基，对照组加HAc溶液，充分灭菌后，接入10 μL供试菌液（最终浓度约为104CFU·mL-1），28℃，128 r·min-1恒温震荡培养，分别于0、3 h、6 h、9 h、12 h和24 h各取100 μL菌液进行MDA及胞外蛋白质含量的测定[16-17]。

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，组内差异采用方差分析，组间差异采用t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌MIC值和MBC值的测定

MIC值指能抑制供试细菌生长的最小样品浓度，MBC值指能杀死99.9%供试细菌的最小样品浓度[9]。试验结果表明，壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌具有较为明显的抑菌效果，通过倍比稀释方法，测定壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌的MIC值和MBC 值分别为 0.25 g·mL-1和 1.0 g·mL-1。这可能因为细菌表面的pH呈中性，壳聚糖在该条件下易被析出并包裹于细菌表面，从而影响细菌的正常生理活动，并产生抑制其生长甚至杀死细菌的作用[18-19]。

2.2 时间对壳聚糖抑菌活性的影响

壳聚糖作用于托拉斯假单胞杆菌的时间曲线见图1。

由图1可知，随着时间的延长对照组细菌总数明显增多。随着壳聚糖浓度的增加，对托拉斯假单胞杆菌的抑制作用也明显增强，其中2倍MIC的壳聚糖能有效抑制细菌生长，使细菌数量减少，4倍MIC浓度的壳聚糖溶液对细菌作用12 h后，基本能完全抑制细菌生长。

2.3 壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌细胞壁完整性的影响

碱性磷酸酶是位于细胞壁与细胞膜之间的一种酶，当菌体细胞结构完整时，胞外碱性磷酸酶的含量很低，而当细胞壁受到破坏后，碱性磷酸酶将大量泄漏到胞外，因此该酶胞外含量可以作为检测细胞壁完整性的指标[20]。壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌胞外碱性磷酸酶活性的影响见图2。

如图2所示，对照组菌体培养液中的胞外碱性磷酸酶活性较低，约为0.6 mU·mL-1，且在整个培养周期内未发生明显变化。而不同浓度壳聚糖处理后，托拉斯假单胞杆菌培养液中的胞外碱性磷酸酶活性较对照组明显增加（P＜0.05），且随着壳聚糖浓度增加、培养时间的延长，其活性随之增加，该研究结果与黄芩提取物对嗜水气单胞菌及松脂醇对铜绿假单胞菌的作用类似[20-21]。因此表明，壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌的细胞壁可产生一定的破坏作用，使胞内物质发生泄漏而抑制其生长。

2.4 壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌细胞膜完整性的影响

很多抑菌剂作用于细菌的细胞膜，通过与细胞膜的相互作用破坏其完整性，首先导致小分子物质如K+和PO43-的释放，而随着破坏的进一步加剧，大分子物质如DNA、mRNA和蛋白质开始发生泄露[14-15，22]。因此通过测定细菌培养液在260 nm及280 nm处的吸光值，可以间接反映细菌细胞膜完整性的变化。壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌核酸类和蛋白质类物质泄露的影响见图3。

如图3所示，与对照相比，随着时间的延长和壳聚糖浓度的增加，260 nm及280 nm处的吸光值显著增加（P＜0.05），尤其是在4×MIC壳聚糖浓度、培养8 h时对托拉斯假单胞杆菌细胞膜的完整性破坏最大，吸光值至达到最大。

2.5 壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌细胞膜通透性的影响

研究表明，壳聚糖能够进入肠杆菌（Enterobacter sp.）和果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum）内部，可能是在酸性条件下，壳聚糖表面存在的大量阳离子基团（NH3+）可以与革兰氏阴性菌外膜上带负电的脂多糖、磷脂及脂蛋白等发生反应，从而破坏细胞膜的结构使其通透性增加，因此，进入细胞内部壳聚糖的含量是反映托拉斯假单胞杆菌细胞膜通透性变化的重要参数[9]。与Lou等[15]的结果类似，壳聚糖亦可以增加托拉斯假单胞杆菌细胞膜的通透性，并随着壳聚糖浓度的升高，其进入细菌内部的含量也随之增加。不同浓度壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌吸收壳聚糖的影响见表1。

表1 不同浓度壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌吸收壳聚糖的影响Tab.1 Effect of chitosan concentrations on the absorption of chitosan by Pseudomonas tolaasii

2.6 壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌MDA和胞外蛋白质含量的影响

MDA是脂质过氧化的代谢产物，常用作脂质过氧化的指标。MDA能进入膜脂的水相，与膜蛋白、膜磷脂上的-NH2交联形成Schiff碱，从而导致细胞膜变硬，流动性降低，通透性增加，而使膜的功能受损，故通过检测其含量可间接反映机体组织受损程度[23-24]。壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌MDA含量和胞外蛋白质含量的影响见图4。

如图4（a）所示，壳聚糖处理组中MDA含量随着壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌作用时间的延长而增加；并且随着壳聚糖浓度的增加，MDA的含量呈逐渐上升趋势。当作用时间为24 h时，4倍MIC壳聚糖处理组的MDA含量为0.170 μg·mL-1，明显高于对照组 0.025 μg·mL-1（P＜0.05）。可能是高浓度的壳聚糖进入托拉斯假单胞杆菌后，破坏了其细胞内的氧化还原系统，使胞内自由基含量增加，脂质过氧化程度加大，影响细胞正常代谢，导致细胞生长受到干扰造成细胞死亡[25-26]。

如图4（b）所示，对照组菌体培养液中的胞外蛋白质含量较低，约0.06 mg·mL-1，且随着培养时间的延长未发生明显变化。而不同浓度壳聚糖处理后，托拉斯假单胞杆菌胞外蛋白质含量较对照组明显增加（P＜0.05），且随着培养时间的延长，其含量随之升高，并呈现一定的剂量依赖性。此结果与上文2.4中细菌培养液在280 nm处吸光值测定结果一致，进一步表明壳聚糖可能破坏了托拉斯假单胞杆菌细胞壁和细胞膜的完整性，导致胞内物质发生泄漏，使胞外蛋白含量增加。

3 结论

平菇细菌性褐斑病在国内外均严重发生，如不及时防治，既影响平菇转潮，又会迅速扩散，甚至导致平菇绝收[7，27]。张瑞颖[6]研究发现，引起我国平菇细菌性褐斑病的病原菌是托拉斯假单胞杆菌。该细菌不仅浸染平菇，亦可引起双孢蘑菇（Agaricus bisporus）、香菇（Lentinula edodes）、金针菇（Flammulina velutipes）等的褐斑病，给菇农造成严重经济损失[7，27]。国内外对平菇细菌性褐斑病的防治主要是在栽培过程中使用农用链霉素、金霉素、春日霉素等化学物质[8]。但平菇子实体生长期较短，一旦使用化学试剂，药剂残留无法降解，会危害人类健康；而壳聚糖具备广谱抑菌性、天然无毒、绿色环保的优良性能，有广阔的应用前景[10]。因此通过研究壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌的生长抑制作用，并对相关抑菌机制进行初步探讨，发现壳聚糖可以明显抑制托拉斯假单胞杆菌的生长，并且经壳聚糖处理后，托拉斯假单胞杆菌的细胞壁和细胞膜完整性受到破坏，细胞膜通透性增加，胞内物质发生泄漏，碱性磷酸酶和胞外蛋白质含量均增加。该结果表明壳聚糖对托拉斯假单胞杆菌的抑菌作用主要是作用于细胞壁、细胞膜上的靶点来实现，这对开发新型绿色安全的抗菌药物奠定了重要的理论基础。