雷蘑胞外粗多糖在运动中抗疲劳促恢复作用研究*

顿仕杰

（天津职业大学，天津 300410）

雷蘑（Clitocybe gigantean），又称为大白桩蘑、青腿子，白色，可食用，子实体较大，质地肥厚，味道鲜美[1]。具备较大的药用价值，可对麻疹患儿进行辅助治疗，并且能够缓解伤风感冒、烦躁不安等症状，可以形成杯伞素（Clitocybin），具备良好的抗肺结核效果[2]，并且具备较高的抗疲劳作用[3]。试验以雄性小鼠为对象分析雷蘑胞外多糖对抗疲劳的效果，探索其对运动恢复的作用。真菌多糖作为一种国际公认的生理机能调节剂，具有丰富多彩的生物活性，而且毒副作用较少，对正常细胞的影响很小，与其他药物具有协同增效作用，同时可对抗不良反应等特点而成为研究热点[4]。近年来，国内、国外学者在深层发酵胞外多糖研究领域做了不少工作，但是对雷蘑胞外多糖抗疲劳作用的研究国内外仍属空白。

1 材料与试验方案

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

本试验所用菌种为雷蘑（Clitocybe gigantean）AS 5.105，试验开始之前购于中国科学院微生物菌种保藏中心。

1.1.2 培养基

液体发酵培养基由土豆汁200 g、葡萄糖40 g、酵母膏 2 g，KH2PO33.0 g、MgSO4·7H20 1.5 g，VB1150 mg组成；斜面培养基为PDA培养基。

1.1.3 试验动物

120只雄性清洁级昆明种小鼠，体重18 g～22 g，来源于蚌埠医学院动物房，动物编号医动字第011号。动物试验室保持良好的清洁状态，相对湿度40%～65%，温度24℃～26℃。

1.2 仪器与药品

COBAS MIRA全自动生化分析仪，瑞士ROCHE公司；RE 52旋转蒸发仪，上海青浦沪西仪器厂；1710血乳酸测定仪，日本京都公司；UV-54紫外可见光分光光度计，日本岛津公司。自制小鼠游泳水箱规格是100 cm×50 cm×50 cm。胞外粗多糖制剂来自上海润裕生物科技有限公司。其余试验所用试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 胞外粗多糖提取及溶液制备

在1 000 mL三角瓶内置入200 mL液体发酵培养基，将斜面试管菌种接种在上面，第4天的将其转接到含有6 L液体发酵培养基10 L种子罐中，继续发酵4 d结束。以3 500 r·min-1离心15 min，取上清液备用；80℃的条件下真空旋转蒸发仪浓缩，浓缩至原体积1/5时，用透析技术对上清浓缩液除去还原糖；再浓缩回原体积，离心除去不溶物，4℃的条件下用95%乙醇静置12 h处理，并取沉淀，以无水乙醇进行3次洗涤，经冷冻干燥处理之后获得胞外粗多糖（CEP）[5]。

对胞外粗多糖进行处理得到母液10 mg·mL-1，稀释之后可以获得设定浓度的溶液。采用间歇灭菌方式完成溶液的灭菌处理，3 500 r·min-1离心5 min，获得上清液。

1.3.2 动物分组和预处理

120只正常生长的小鼠作为试验对象，对试验环境及相关条件进行3 d的适应，之后将小鼠随机均分为4组，每组30只，运用t检验发现小鼠体重的组间差异不明显，达到试验标准。采取摄食及饮水自由的方式，并且关照时间也是根据自然规律进行控制，在称重处理之后进行给样处理。冷冻干燥的胞外粗多糖（CEP）剂量组包括剂量300组300 mg·kg-1·d-1、剂量 200 组 200 mg·kg-1·d-1、剂量 100组100 mg·kg-1·d-1。此 3组每天早晨每鼠灌胃 0.5 mL胞外粗多糖1次。对照组以等量0.9%生理盐水进行灌胃处理。小鼠接受28 d喂养后，展开游泳试验，对有关参数进行检测，并且针对参数的具体影响进行评估。

1.3.3 负重游泳试验

每组抽取小鼠10只，最后1次给药0.5 h之后，在与尾尖之间距离是1 cm的位置，以5 cm长细棉线将小鼠体重5%的铅丝系在小鼠上，并且在（30±1）℃的水箱中强迫小鼠进行游泳运动，并且水箱规格设置为100 cm×50 cm×50 cm。用秒表详细记录小鼠从开始游泳到最终力竭沉入水底的用时及相关表现。

1.3.4 血尿素氮（BUN）含量测定

在各组中分别随机抽取小鼠10只，最后1次给药0.5 h后，在（30±1）℃的水箱内强迫小鼠进行游泳运动，1.5 h后将其取出，以摘眼球的方式采集血液，并且进行离心处理后取血清，检测血尿素氮含量。

1.3.5 肝糖原测定

取1.3.4处理后的小鼠肝脏，用生理盐水漂洗，以滤纸使其干燥；称取100 mg，在8 mL 5%的TCA内，进行匀浆处理；3 000 r·min-1离心5 min后取上清液1 mL，将其添加至4 mL 95%乙醇内，并且有效混匀，直到界面消失之后，进行12 h的沉淀处理后；经离心处理后将上清液去除，以重蒸水2 mL将其充分溶解，并将其转移到规格是10 mL比色管内；于标准管内添加1 mg·mL-1葡萄糖标准液0.5 mL及重蒸水1.5 mL，空白管内添加2 mL重蒸水，把比色管放在冰水浴处理，添加蕙酮试剂10 mL，充分混合后，放至室温，100℃水浴处理15 min；之后采取冰水浴处理，放至常温之后，充分混合，以紫外分光光度计于620 nm处进行吸光度检测[6]。

1.3.6 血乳酸（BLA）测定

抽取小鼠10只，最后1次给药0.5 h后，将小鼠体重5%的铅皮系在小鼠身上，在（30±1）℃的水箱内强迫小鼠进行10 min的游泳运动。在游泳开始之前及结束后即刻、结束后20 min的时候，于眼内毗静脉丛进行血液采集，采集的量是20 μL，并将其添加到40 μL破膜液内，充分摇匀。借助乳酸测定仪进行LA水平进行检测。

1.4 统计分析

在数据分析时运用SPSS 15.0，并且以SSR技术进行组间对比分析及组内对比分析，结果采用（±s）表示。

2 结果分析

2.1 胞外粗多糖对小鼠相对生长率的影响

胞外粗多糖对小鼠体重及相对生长率的影响情况见表1。

表1 胞外粗多糖对小鼠体重及相对生长率的影响情况Tab.1 Effects of extracellular polysaccharides on body weight and relative growth rate of mice

由表1可知，雷蘑AS5.105胞外粗多糖会干预小鼠的运动能力及抗疲劳水平，小鼠的相对生长率也会受其影响。雷蘑AS5.105胞外粗多糖对始重、终重量无显著影响，并且相对生长率也并未存在明显的变化（P＞0.05）。

2.2 负重游泳试验结果。

雷蘑胞外粗多糖对小鼠游泳时间的影响，具体情况见表2。

表2 胞外粗多糖对小鼠游泳时间的影响Tab.2 Effects of extracellular polysaccharides on swimming time in mice

由表2可知，剂量100组与对照组差异不明显，而剂量200组、剂量300组游泳时长差异显著（P＜0.05），说明剂量依赖性相对较高。由于游泳时长能够直接体现动物运动疲劳情况，说明雷蘑AS 5.105胞外粗多糖可以让小鼠对运动的适应性得到强化，能显著加强耐力及运动能力，E200组、E300组的抗疲劳效应显著。

2.3 肝糖原、血尿素氮测定试验结果

雷蘑胞外粗多糖对肝糖原和血尿素氮含量的影响见表3。

表3 胞外粗多糖对肝糖原和血尿素氮的影响Tab.3 Effects of extracellular crude polysaccharides on liver glycogen and BUN

由表3可以看出，小鼠游泳后，肝糖原水平会提高、血清尿素氮含量提升程度降低。E100组与对照组的血清尿素氮含量相比差异很小，E200组、E300组血清尿素氮含量较对照组显著降低（P＜0.01）。与对照组相比，肝糖原含量在3个试验组中显著提升，并且试验组和对照组相比的差异显著（P＜0.01）。这就表明雷蘑AS 5.105胞外粗多糖可以提高血糖与肌糖原水平。机体的能量代谢失衡现象能被有效缓解，对蛋白质过量分解的问题也能有效解决，疲劳问题也能因此显著改善。

2.4 血乳酸测定试验结果

不同剂量胞外粗多糖对游泳小鼠血乳酸比值的影响情况见表4。

表4 胞外粗多糖对游泳小鼠血乳酸比值的影响Tab.4 Effects of extracellular polysaccharides on blood lactic acid ratio in swimming mice

由表4可以看出，E100组血乳酸含量与对照组相比差异较小（P＞0.05）。而E200组、E300组会在很大程度上出现抑制小鼠运动结束之后血乳酸水平提升的现象，有助于运动之后血乳酸水平的降低，剂量依赖性非常显著（P＜0.05）。雷蘑胞外粗多糖能够使得有氧代谢能力显著强化，可以使得游泳运动之后小鼠机体内形成的乳酸水平得到有效下降，有效缓解运动疲劳症状。

3 讨论与结论

在运动期间，糖、脂肪分解代谢获得的能量并不能达到机体所需，蛋白质会分解代谢并因此完成能量供给，能够为机体供给大概5%～10%能量，进而使得糖原供给缺乏的症状得到改善[7]。剂量200组、剂量300组运动后，血尿素氮水平明显降低，出现此种现象的主要是因为能量代谢问题得到了有效解决，糖、脂肪在运动期间的能量供给得到了加强，这就会使得肌肉内蛋白质供给能量的比重得到提升，而肌肉中能量失衡的现象也能因此得到改善，机体也能更好地强化对负荷的适应性，以此促进得了疲劳的消除。

糖原是机体细胞存储糖分的有效形式，可以有效调控机体内的血糖水平，若是患者的血糖水平相对较高，就能够促进肝糖原的合成；若是血糖水平相对较低，就能够促进肝糖原的分解，并因此提升血糖水平[8]。此外，糖原是运动过程中能量的关键性来源[9]，所以，将糖原储备量提升，能够使得机体的运动能力及耐力显著强化，有效缓解疲劳[10]。小鼠游泳后，肝糖原水平会提高、血清尿素氮含量提升程度降低，这就表示雷蘑AS 5.105胞外粗多糖可以提高血糖与肌糖原水平，机体的能量代谢失衡现象能有效缓解，对蛋白质过量分解的问题有效解决，疲劳问题也能因此显著改善。

综上所述，雷蘑AS 5.105胞外粗多糖能够使得小鼠负重游泳时长显著延长，可以减小血乳酸及血清尿素氮水平降低，促进机体中肝糖原储备水平的提升，改善疲劳症状。