痛风及高尿酸血症患者HLA-B*5801 基因携带情况及其与别嘌醇过敏反应间的相关性研究*

张卫忠，施春花，王友莲

(江西省人民医院风湿免疫科，南昌330006）

别嘌醇是一种黄嘌呤氧化酶抑制剂， 能有效减少尿酸合成，作为降尿酸药物疗效显著、价格低廉，在临床上广泛用于治疗高尿酸血症、痛风和痛风性关节炎等疾病。 然而在使用过程中，别嘌醇容易引起各种不良反应，有常见的药疹、发热、肝肾功能损害及血液系统损害[1]；也有严重的皮肤不良反应， 如中毒性表皮坏死松解症(toxic epidermal necrolysis，TEN)、 重 症 渗 出 性 多 形 红 斑 药 疹(Stevens-Johnson syndrome，SJS) 及超敏综合征(hypersensitivity syndrome，HSS)等，发病率约5%，病死率高达30%-50%[2]。 近年来，别嘌醇的过敏反应成为国内外学者关注的热点。 2005 年，Hung 等[3]报道台湾人群使用别嘌醇治疗而产生严重不良反应与HLA-B*5801 等位基因之间存在相关性， 随后国内外文献[4-7]也有相关报道。2013 年的《高尿酸血症和痛风治疗中国专家共识》中推荐痛风及高尿酸血症患者使用别嘌醇前检测HLA-B*5801 基因。最新的美国临床药理学治疗指南[8]也提出在口服别嘌呤醇之前对患者进行HLA-B*5801 基因型检测是很有必要的， 等位基因型阳性者不主张服用别嘌醇，建议服用其他替代药物。 但是不同地区、国家、 种族之间，HLA-B*5801 基因携带情况以及其别嘌醇相关药疹之间的关联性差异很大， 而且中国很多地区缺乏HLA-B*5801 基因携带情况的研究分析， 尤其是江西省内各地区缺乏该基因流行性的调查。而且很少有医院开展该基因检测。由于HLA-B*5801 基因检测比较昂贵， 很多痛风及高尿酸血症患者考虑经济原因对该项检测比较顾虑。 本研究希望通过调查南昌市痛风及高尿酸血症患者HLA-B*5801 基因携带情况及与别嘌醇相关药疹之间的相关性， 来指导本地痛风及高尿酸血症患者选用合适药物治疗。

1 资料与方法

1.1 研究对象 研究对象为在2018 年6 月至2019年1 月期间就诊于江西省人民院的痛风及高尿酸血症患者。 其中痛风的诊断标准参考2015 年美国风湿病学会/欧洲抗风湿联盟痛风分类标准[9]；高尿酸血症诊断标准： 男420μmol/L （7mg/L）， 女360 μmol/L（6mg/L）。入选患者年龄18-75 岁。将服用别嘌醇的痛风及高尿酸血症患者分为两组， 其中服用别嘌醇而过敏的11 例患者纳入别嘌醇过敏组；服用别嘌醇超过6 个月但未发生任何不良反应的患者21 例纳入别嘌醇耐受组；在江西省人民医院就诊且未服用过别嘌醇的痛风及高尿酸血症患者共80 例纳入对照组。 详细记录受试者的相关资料，包括性别、年龄、家庭住址、民族、临床诊断、药物使用情况、 出现的药物不良反应情况及相应的治疗情况等。 所有受试者均知情同意并签署了知情同意书，且通过医院伦理委员会的审核批准。

1.2 方法 使用EDTA 抗凝管采集各受试者静脉血3mL，提取血液DNA，并测定DNA 浓度和纯度，利用安徽同科生物科技有限公司的人类HLAB*5801 基因检测试剂盒（PCR 多色荧光法） 进行HLA-B*5801 等位基因检测。 其中该试剂盒针对HLA-B*5801 等位基因设计了一套特异性引物和探针组合， 在一个反应体系中利用两荧光通道检测目标基因。 在反应体系含有对应基因型模板的情况下，PCR 反应得以进行，并利用荧光定量PCR仪对反应过程中释放出的相应荧光信号进行实时检测和输出，实现HLA-B*5801 等位基因的检测。其中JOE 荧光为内参基因信号，ROX 和FAM 为HLA-B*5801 等位基因信号。检测过程中所有操作均由经培训后的专人严格按照试剂盒说明书进行。

结果判读：FAM、JOE 和ROX 的Ct 值均≤38，HLA-B*5801 阳性； 其中JOE≤38，FAM 或ROX不均≤38，HLA-B*5801 阴性；若JOE（内参）Ct 值＞38，可能存在PCR 抑制，需对样本进行复测。

1.3 统计学方法 采用SPSS18.0 统计学软件对研究数据进行统计分析， 计数资料比较采用Fisher确切概率法和卡方检验。HLA-B*5801 等位基因与别嘌醇过敏间的关联强度使用比值比 （odds ratio,OR）和95%可信区间（confidence interval,CI）反映。P＜0.05 为差异有统计学意义。HLA-B*5801 等位基因阳性判断别嘌醇过敏的敏感度=别嘌醇过敏组HLA-B*5801 阳性数/别嘌醇过敏组总人数×100%；HLA-B*5801 等位基因阴性判断别嘌醇耐受的特异度=别嘌醇耐受组HLA-B*5801 阴性数/别嘌醇耐受总人数×100%。

2 结果

2.1 HLA-B*5801 等位基因检测情况 所有受试者的内参基因（JOE）全部扩增，且Ct 值均＜38，受试者检测结果根据HLA-B*5801 检测试剂盒的说明书进行判读。 112 位受试者中，HLA- B*5801 等位基因阳性23 例（占20.5%），其中男性有16 例，女性7 例；HLA- B*5801 等位基因阴性89 例（占79.5%），其中男56 例，女33 例，检测结果见表1。

表1 HLA-B*5801 等位基因检测情况n（%）

图1 HLA-B*5801 基因检测扩增图（左：阳性/右：阴性）

在检测结果中， 随机选取了HLA-B*5801 等位基因阳性、阴性的扩增结果各1 例，见图1。由图知，两受试者的内参基因（JOE）荧光通道均有曲线扩增，Ct 值在34 左右，小于38，检测有效，其中一受试者的HLA-B*5801 基因（FAM 和ROX）荧光通道有扩增曲线，Ct 值在32 左右， 小于38，HLAB*5801 等位基因阳性； 而另一受试者的HLAB*5801 基因（FAM 和ROX）荧光通道无扩增曲线，HLA-B*5801 等位基因阴性。

2.2 别嘌醇过敏与HLA-B*5801 基因相关性 别嘌醇过敏组受试者HLA-B*5801 等位基因阳性率为90.9%（10/11）， 别嘌醇耐受组受试者HLAB*5801 等位基因阳性率为9.5%（2/21），对照组受试者HLA-B*5801 等位基因阳性率为13.8%（11/80）； 别嘌醇过敏组与别嘌醇耐受组比较，HLAB*5801 等位基因阳性者发生别嘌醇过敏的风险是HLA-B*5801 等位基因阴性者的95 倍 （OR=95，95% CI:7.6-1180.3，P＜0.001）， 该基因阳性判断别嘌醇过敏的敏感度为90.9%，该基因阴性判断别嘌醇耐受的特异度为90.5%。别嘌醇过敏组与健康对照组比较，HLA-B*5801 等位基因阳性者发生别嘌醇过敏的风险是HLA-B*5801 等位基因阴性者的62.7 倍（OR=62.7，95% CI:7.3-539.5，P＜0.001）（表2）。

3 讨论

表2 各组携带HLA-B*5801 等位基因情况

在本研究中,健康对照组HLA-B*5801 等位基因阳性率为13.8%, 与国内人群的阳性率14%-20%[3-5]相似，显著高于欧洲（0.8%）及日本（0.6%）[2]，但低于曾大勇[10]等的研究(20.4%)，与不同地区人群的HLA-B*5801 等位基因携带率有差异理论相符[11]。 关于不同地区有不同的携带率的研究，后续可针对不同地域区内的受试者进行深入探究。HLA-B*5801 该标志基因的危险度（OR=95）低于Hung 等[3]（OR=580.3）及高杰等[2]（OR=403），但 高于曾大勇等[10]（OR=65.6），可能与研究的样本数量及区域位置有关， 该研究证明HLA-B*5801 等位基因与别嘌醇过敏之间有关联。

研究所用的实时荧光定量PCR 技术是在反应体系中加入针对HLA-B*5801 等位基因设计了一套特异性引物和探针组合， 且反应体系中加入了对内参基因的检测，能够更好的对样本DNA 的提取及扩增进行监控，避免假阴性结果，提高试验数据准确性。 荧光定量PCR 比常规PCR 特异性更强、灵敏度更高、分析结果快速，而且整个PCR 反应过程均在完全闭管状态下进行， 无需冗长的后处理， 有效避免了常规PCR 产物造成的潜在实验室污染问题。

近年来，由于肥胖、肾功能不全及高血压发病率逐年上升,高尿酸血症及痛风的发病率也随之上升。根据《2016 年中国痛风指南》[12]，我国不同地区,不同时间段痛风患病率在1%-3%， 且呈逐年上升趋势[13]。别嘌醇作为降尿酸、治疗痛风的一线药物，特别受人们的青睐,然而别嘌醇引起的严重过敏反应成为临床应用的难题。 在江西地区，痛风及高尿酸血症的发病率高, 但存在很多患者未规律就诊，包括不规范使用药物及监测血尿酸指标等。 在使用别嘌醇前很少患者曾检测过HLA-B*5801 等位基因，存在用药风险[14]。 本研究及其他研究[2-3,5-7,15,16]都已证实HLA-B*5801 等位基因与别嘌醇过敏有很强的相关性， 且HLA-B*5801 等位基因阳性率在亚裔汉族人群中具有相当高的比例[14]，对即将服用别嘌醇的病患者进行HLA-B*5801 等位基因的检测，有助于降低别嘌醇过敏反应的发生，指导患者安全合理用药。