P38MAPK在正常豚鼠耳蜗中的表达

廖行伟 黄巧 翟思佳 尹时华

广西医科大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科（南宁530007）

p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是高度保守的丝氨酸/苏氨酸丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族成员，共有6个亚型，包括p38α1/α2、p38β1/β2、p38γ和p38δ[1]。p38MAPK在去磷酸化状态下无活性，当细胞受到紫外线、炎性因子、细胞因子、DNA损伤等刺激后，p38MAPK被激活磷酸化，磷酸化的p38MAPK(p-p38)可活化一系列底物如转录因子、蛋白激酶、胞浆和胞核蛋白等，引发炎症反应、细胞分化、细胞周期停滞、凋亡、衰老、细胞因子产生以及RNA剪接调控等，且这种活化作用通常具有组织细胞特异性[2]。

梅尼埃病是一种以波动性听力损失和前庭功能障碍为主要表现的疾病，主要由于内耳内环境紊乱和淋巴囊系统调节失效，导致膜迷路积水从而引起相应症状[3，4]。水通道蛋白（AQP）是存在于哺乳动物和植物细胞膜上的特异孔道，其功能是介导水在细胞的跨膜转运，维持生命基本活动[5]。在豚鼠膜迷路积水模型研究发现，膜迷路积水可能与AQP2的表达上调有关[6]。而在小鼠肾脏集合管细胞中，通过p38MAPK途径能够改变AQP2蛋白酶体降解，增强AQP2在肾脏的表达[7]。p38MAPK是否通过调控AQP2参与内耳膜迷路积水形成并不清楚，本实验期望通过研究p38MAPK在豚鼠内耳中的表达，以进一步深入了解膜迷路积水、梅尼埃病的发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

P38MAPK兔抗鼠单克隆抗体购自美国CST公司；SBAC二抗试剂盒、过氧化物酶阻滞剂及DAB显色剂均购自boster公司；TRIZOL购自TaKaRa公司；逆转录盒与荧光定量PCR试剂盒均购于天根生化科技有限公司；引物由上海生工生物公司合成并经过质量检验。

1.2 实验动物选择与取材

选取耳廓反射灵敏体重250-300g的健康红目豚鼠10只，由广西医科大学动物实验中心提供，并排除听性脑干反应（ABR）检测阈值大于40dBSPL和畸变产物耳声发射（DPOAE）不通过者。

1.2.1 ABR和DPOAE检测

以10%水合氯醛（0.5～0.6ml/100g）腹腔注射麻醉满意后对豚鼠进行ABR测试，记录电极置于额顶正中，参考电极接测试耳乳突，鼻尖接地，极间电阻小于1kΩ。click短声刺激，强度90dBSPL到0 dBSPL，衰减间隔10dB，接近阈值时，衰减间隔5 dB，带通滤波300～3000Hz，刺激速率为21次/秒，叠加1024次。以能引出可分辨Ⅱ波的最小刺激强度为反应阈值，并重复检测2次。随后进行DPOAE幅度测试，将f2/f1比率固定在1.20，刺激声强度L1=65dB SPL，L2=70dB SPL，取2k、3k、4k、6k、8k、10k共6个频率点进行测试，记录各频率左、右耳的平均DPOAE反应幅值。

1.2.2 实验动物取材

豚鼠按40mg/kg1%戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉，打开胸腔予以生理盐水进行心脏灌注，至口唇苍白后换为4%多聚甲醛继续灌注，待颈僵直后迅速断头、取出听泡后剥离耳蜗，同时取出肾组织。再将耳蜗置于4%多聚甲醛中，在4℃冰箱内固定48h。10%乙二胺四乙酸（EDTA）中脱钙1月，期间隔天更换脱钙液。将已脱钙的耳蜗于各梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，以4um的厚度沿蜗轴切片。

1.3 qRT-PCR

将豚鼠麻醉、灌注后迅速取出双侧耳蜗，置入RNA保存液中，在解剖显微镜下剥离蜗壳，取出膜迷路组织，迅速放入已加入300μl TRIZOL的1.5mLEP管中，用玻璃研磨棒在EP管中快速研磨碎，另加入 700μl TRIZOL，冰上放置 10min。按Trizol试剂盒说明严格操作，提取总RNA，然后将RNA溶于无酶水中，微量核酸蛋白检测仪测定RNA浓度。将mRNA反转录为cDNA，qRT-PCR检测样本p38MAPK表达，反应条件：95℃15min，95℃15s，60℃30s，总共40个循环。以β-actin为内参，每组设3个复孔，重复3次。引物序列：p38MAPK F:5'-CAGCTTCAGCAGATTATGCGT-3'，R:5'-AGCCACTGGTTCATCGTCAG-3'；β -actin F:5'-GCCAACCGTGAGAAGATGAC-3'，R:5'-AGGCATACAGGGACAGCACA-3'。

1.4 免疫组化

65℃烤箱烤片2h，二甲苯脱蜡1h，将切片依次放入100%、95%、80%、75%乙醇纯化各5min，柠檬酸缓冲液高压修复7min，离开热源自然冷却，弃去抗原修复液，PBS淋洗5min，将切片移入湿盒中加入过氧化物酶阻滞剂，以去除内源性过氧化物酶封闭液，室温孵育10min，PBS充分淋洗5min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min，水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗(p38MAPK 1:100)，放入湿盒，4℃孵育过夜，37℃复温1小时，滴加二抗工作液，室温孵育1h，PBS充分淋洗，DAB显色5min，PBS冲洗1min，苏木精复染3分钟，盐酸酒精分化30s，饱和碳酸锂返蓝5min，脱水，透明，封片。肾脏做阳性对照，镜下组织出现黄色或棕色颗粒为阳性。采用Image-ProPlus6.0计算耳蜗切片免疫组化阳性各部位平均光密度值（OD值）。

1.5 统计分析

所有数据以SPSS23.0软件处理，资料以均数±标准差（±s）进行统计描述。耳蜗各部位OD值比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为有差异，GraphpadPrism8.0作图。

2 结果

2.1 听力测定结果

ABR豚鼠听阈28.00±3.49dBSPL，DPOAE检测通过，符合实验动物要求。

图1 豚鼠ABR听阈测定结果Fig.1 The results of guinea pig ABR hearing threshold measurement

图2 豚鼠DPOAE测定结果Fig.2 The results of guinea pig DPOAE measurement

2.2 qRT-PCR

豚鼠耳蜗样本中p38MAPK mRNA显示指数增长，并达到平台期，其扩增曲线为一组典型的倒S型曲线，扩增效率较高（图3a），PCR产物熔解温度均一，熔解曲线峰型单一，产物特异性好（图3b）；p38MAPK mRNA在正常豚鼠耳蜗中的表达量为1.0733±0.2608（图3c）。

图3 豚鼠耳蜗样本中p38MAPK mRNA显示指数增长，并达到平台期，其扩增曲线为一组典型的倒S型曲线，扩增效率较高（a）；PCR产物熔解温度均一，产物熔解曲线峰型单一，产物特异性好（b）；p38MAPK在正常豚鼠耳蜗中的表达量为1.0733±0.2608（c）Fig.3 The mRNA of p38MAPK in guinea pig cochlear samples showed exponential growth and reached plateau.The amplification curve was a typical inverted S-shaped curve with higher amplification efficiency(a);PCR production melting temperature is uniform,The peak type of product melting curve is single and the specificity of product is good(b);The mRNA relative expression of p38MAPK in the normal guinea pig cochlea is 1.0733±0.2608(c)

2.3 免疫组化

以p38MAPK在肾脏的表达作为阳性对照，p38MAPK主要表达于肾集合管（图4a）。以生理盐水代替p38MAPK一抗作为实验的阴性对照，见耳蜗各部位无显色（图4b）。P38MAPK在豚鼠耳蜗中广泛表达于血管纹（StV）、螺旋韧带（SPL）、前庭膜（RM）、Corti器（OC）、螺旋缘（SLM）、螺旋神经节（SG）（图4c-g）。其中螺旋神经节相对于其他部位表达较弱，差异具有统计学意义（P＜0.001，图5），余部位表达无明显差异（P＞0.05）。

图4 p38MAPK主要表达于肾集合管（a）；以生理盐水代替p38MAPK一抗作为实验的阴性对照，见耳蜗各部位无显色（b）；P38MAPK在豚鼠耳蜗中广泛表达于StV、SPL、RM、OC、SLM、SG，在SG处表达相对较弱（c-g）Fig.4 p38MAPK is mainly expressed in the renal collecting duct(a);physiological saline is used instead of p38MAPK primary antibody as a negative control of the experiment,and no coloration occurs in various parts of the cochlea(b);P38MAPK is widely expressed in StV in the guinea pig cochlea,SPL,RM,OC,SLM,SG,expressed relatively weakly at SG(c-g).

图5 SG相对于其他部位表达较弱，差异具有统计学意义，余部位表达无明显差异。Fig.5 SG is weakly expressed relative to other parts,the difference is statistically significant,and there is no significant difference in the expression of the remaining parts.

3 讨论

内耳是充满液体的感觉器官，将机械刺激转化为听觉和平衡感。这些神经感觉功能依赖于内耳的两个主要细胞外液区—外淋巴和内淋巴的体积的严格调节。水通道蛋白家族（AQPs）是精确调节外淋巴和内淋巴体积的分子候选物[8]。已经在内耳的膜迷路中鉴定出八种AQP亚型。类似的AQP亚型也在肾脏中表达，其在全身水调节中起作用。在内耳中，AQP亚型在不同的细胞类型中普遍表达，表明AQP在外淋巴和内淋巴的体积调节中具有重要的生理作用。此外，受干扰的AQP功能可能具有病理生理学相关性，并可能将AQP转变为治疗内耳疾病的治疗靶点[9]。

P38MAPK与AQP家族关系密切。在急性CO中毒大鼠脑水肿模型中，AQP1和AQP4参与促进了CO中毒诱导脑水肿的发生发展进程，而抑制p38MAPK通路则能够明显抑制这种诱导效应[10]。在大鼠败血症模型中，抑制P38MAPK的炎性细胞因子和磷酸化可以上调AQP5的表达，从而保护脓毒症大鼠的肺组织[11]。激活后的p38MAPK可以诱导AQP3的表达下调和AQP9的表达上调，两者相结合参与油酸诱导的肝脂肪变性[12]。AQP8能够增加过氧化氢诱导的p38MAPK的磷酸化[13]。p38抑制剂可以抑制培养的星形胶质细胞中的AQP4和AQP9表达[14]。而在小鼠肾脏集合管细胞中，通过p38MAPK途径能够改变AQP2蛋白酶体降解，增强AQP2在肾脏的表达[7]。在豚鼠膜迷路积水模型研究发现，膜迷路积水与AQP2的表达上调有关[6]。基于此，我们合理推测p38MAPK可能通过调控AQP2参与膜迷路积水的形成。

研究发现，AQP2在大鼠耳蜗血管纹（SV）的基底细胞、上皮下组织中的II型纤维细胞、内毛细胞（IHC）、螺旋神经节细胞表达较强，而在外毛细胞（OHC）中表达相对较弱[15]。本研究中发现，p38MAPK广泛表达于豚鼠血管纹、螺旋韧带、cori器、螺旋缘、螺旋神经节，这与AQP2在耳蜗的表达部位大致相当，更加增大了p38MAPK通过调控AQP2参与膜迷路积水的形成的可能性，当然这需要我们在下一步的研究中进一步证实。上皮钠通道（ENaC）作为高选择性Na+通道，参与膜迷路积水的形成，而ENaC在豚鼠耳蜗中表达于血管纹、螺旋韧带、前庭膜、螺旋神经节、Corti器、螺旋缘等部位[16]，p38MAPK与此别无二致，p38MAPK是否也通过ENaC参与膜迷路积水形成，这在我们后续的实验中有待进一步研究证实。

本实验首次研究了p38MAPK在豚鼠耳蜗各部位的表达，发现p38MAPK的表达部位与AQP2及ENaC在耳蜗表达部位大致重合，我们合理推测p38MAPK可能通过调节AQP2及ENaC参与膜迷路积水的形成。