乳腺癌患者唾液中转铁蛋白、间-α胰蛋白酶抑制因子重链H1、α2巨球蛋白及锌指同源框蛋白4水平测定及临床意义

孙宁宁，范大华，孙珂焕，曹美群

(深圳市第二人民医院、深圳市老年医学研究所，广东 深圳 518035)

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，临床常见，且发病率呈逐年上升的趋势[1]。目前，对乳腺癌的诊断主要依据病理结果，确诊时通常已经处于晚期，而错过最佳手术时间。因此，早期诊断对于乳腺癌患者的救治十分关键。唾液检测目前已成为一种可行的、优势明显的检测方法。唾液作为提供生物标志物的体液，其中独特、丰富的蛋白质成分毫无疑问是潜在和理想的疾病诊断与药物筛选的无创伤性生物靶标，可为临床疾病诊断提供重要的参考依据，这提示唾液可能为今后的临床诊断提供一种新的检测样品来源[2]。本研究采集18例乳腺癌患者唾液，检测转铁蛋白(transferrin, TF)、间-α胰蛋白酶抑制因子重链H1(inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H1, ITIH1)、α2巨球蛋白(alpha-2-macroglobulin，α2M)及锌指同源框蛋白4(zinc finger homeobox protein 4, ZFHX4)4个肿瘤相关蛋白的水平，并与18例健康女性作为对照，分析这些蛋白在乳腺癌患者唾液中的水平变化规律。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2016年8月至2017年12月就诊于湖南中医药大学第一附属医院的18例女性乳腺癌患者和18例健康女性作为研究对象。18例乳腺癌患者均通过2位及以上病理科专家确诊。18例健康女性均无乳腺癌及其他系统恶性肿瘤病史。乳腺癌患者年龄(51.38±1.97)岁，对照组患者年龄(48.61±2.40)岁，比较差异无统计学意义(t=0.894，P=0.377)。本研究已经通过医院伦理委员会的批准，且获得受试者的知情同意。

1.2 实验材料酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒：TF(批号：ab108902)和α2M(批号：ab108883)均购自美国abcam公司；ITIH1(批号：abx250565)和ZFHX4(批号：abx153533)购自英国abbexa公司。

1.3 方法

1.3.1 唾液标本的采集和处理 采用非刺激性唾液采集方式收集唾液样品，具体操作方法如下[3]：前1天晚上临睡前清水漱口3次(不再进食任何食物或药物)，当天起床后漱口前空腹收集唾液，患者将已消毒的无菌棉球放入口中，唾液积聚至一定量后，将棉球吐入10 mL唾液离心管内。4 ℃条件下，3 000 r/min离心5 min，将唾液分装于1.5 mL EP管中，并加入蛋白酶抑制剂，于-80 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 ELISA检测唾液中4个肿瘤相关蛋白 按照ELISA检测试剂盒说明书进行TF、ITIH1、α2M及ZFHX4等4个肿瘤相关蛋白的浓度。将样品稀释至合适浓度，将标准品和样品依次加入已包被抗体的96孔板中，每个样品和标品均3个重复孔。根据试剂盒说明书目的蛋白与包被抗体结合后，去除未结合样品；加入生物素修饰的抗体，孵育完成后洗涤去除多余的生物素化抗体；然后利用生物素与亲和素结合原理加入亲和素标记的辣根过氧化物酶，按说明书要求去除多余的辣根过氧化物酶；最后加入四甲基联苯胺底物显色,终止液终止，酶标仪在450 nm波长下读取各孔吸光度值，根据标准品吸光度值绘制标准曲线，计算各样品中目的蛋白水平。

1.4 生物信息学分析应用STRING数据库构建差异蛋白相互作用网络。应用生物信息学分析工具KEGG数据库对蛋白所涉及的通路进行分类和富集分析。

2 结果

2.1 乳腺癌患者和健康女性唾液中TF、ITIH1、α2M及ZFHX4水平比较乳腺癌患者唾液中TF、ZFHX4水平分别为(3.092±0.309)mg/L、(0.546±0.084)μg/L，均高于健康女性的(2.231±0.217)mg/L、(0.207±0.059)μg/L，差异均有统计学意义(t=2.281，P=0.030；t=3.310，P=0.003)。乳腺癌患者唾液中ITIH1、α2M水平分别为(0.162±0.105)μg/L、(2.448±0.218)mg/L，均低于健康女性的(1.709±0.384)μg/L、(3.568±0.258)mg/L，差异均有统计学意义(t=3.891，P=0.001；t=3.318，P=0.003)。

2.2 生物信息学分析结果

2.2.1 STRING数据库分析结果 通过STRING数据库对TF、ITIH1、α2M及ZFHX4等4种蛋白进行蛋白相互作用分析，结果发现TF和α2M具有相互作用。TF是一个核心蛋白，还与表皮生长因子(EGF)、血色素沉着症蛋白(HFE)、重组人转铁蛋白受体(TFRC)、载脂蛋白B(APOB)、人丝氨酸蛋白酶抑制因子肽酶抑制因子1(SERPINA1)等多个蛋白具有相互作用，可能在乳腺癌发生发展中起重要作用。见图1。

2.2.2 KEGG数据库分析结果 通过KEGG数据库进行代谢通路分析发现，TF存在于缺氧诱导因子-1(HIF-1)信号通路上，该通路在细胞生长发育和生理应激以及肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。见图2。

图1 蛋白相互作用图

3 讨论

无创诊断是现代医学发展的目标，近年来国外正在尝试以唾液代替血液建立全新的无创性唾液诊断学[4-7]。唾液是机体不可缺少的一种重要体液，血液中多种成分均可通过毛细血管壁进入唾液，体内各种病理生理变化会间接影响唾液组成[8]。近年来，国内外学者在研究以唾液代替血液用于临床疾病诊断的价值中取得了不少研究成果，发现唾液可以作为疾病诊断及治疗过程中病情检测的重要参考指标[9-11]。因此，本研究采集乳腺癌患者唾液，检测与乳腺癌相关的TF、ZFHX4、ITIH1和α2M等4个蛋白水平，探索乳腺癌患者唾液中蛋白水平变化规律。

TF是由肝脏合成的一种单链糖蛋白家族，广泛存在于体液中，不仅参与铁的运输与代谢，同时还具有抗菌活性、促细胞生长分化及细胞保护等许多生理生化功能，是一类多功能蛋白[12]。已有研究[13]显示，TF在结直肠癌患者血清中表达水平升高，通过对血清TF及癌胚抗原联合检测，提高了结直肠癌筛查敏感性。而且血清TF作为肿瘤标志物，其辅助检测价值已得到大家的认可[14]。本研究发现，乳腺癌患者唾液中TF水平较健康女性明显升高，从而推测唾液TF可能会成为乳腺癌辅助诊断指标。

α2M是一种四聚体，富含二硫化物的蛋白酶抑制剂，广泛存在于动物血液中，在动物防御系统中扮演着重要角色[15-16]。α2M在辐射防护机制中的作用可以从以下5个方面概括：抗氧化、抗纤维化、抗炎症、维持体内平衡、增强DNA修复和细胞恢复过程[16]。α2M与多种肿瘤有密切联系。研究[17]表明，血清α2M在乳腺癌被诊断之前表达水平显著低于正常组，可用于乳腺癌早期筛查，而且在乳腺癌化疗过程中，血清α2M水平的变化较为明显，α2M还可以用于乳腺癌的治疗监测。本研究发现，乳腺癌患者唾液中α2M水平较健康女性显著下降。因此，唾液中α2M可能对于乳腺癌的早期诊断及预后判断具有重要的参考意义。

图2 HIF-1信号通路图

ITIH1是ITIH家族成员之一，该家族成员作为细胞外基质的主要成分之一，在炎症和癌变过程中扮演着重要的角色[18]。已有文献[19]报道，ITIH1在体外可以增强细胞附着，在小鼠模型体内可以减少肿瘤细胞转移数量。此外，ITIH1已被证明在炎症和癌变中发挥着特别重要的作用，在乳腺癌、结肠癌和肺癌在内的多种恶性肿瘤的发生和进展过程中ITIH1基因表达出现明显下调现象[18]。本研究结果也表明，乳腺癌患者唾液中ITIH1水平较健康女性显著下降，与文献报道结果一致。因此，ITIH1可以作为乳腺癌诊断的辅助检测指标。

ZFHX4蛋白是一个相对分子质量397 000的转录因子[20]。已有文献报道该蛋白在肌肉和大脑中高度表达，且在胚胎时期表达水平最高，随着年龄的增加该蛋白表达量逐渐降低，直至几乎无法检测到的水平[21]。但研究者发现ZFHX4蛋在食管鳞癌组织中过量表达，而且发现ZFHX4蛋白在体外可以显著抑制细胞迁移和入侵[22]。研究发现，ZFHX4基因不仅在食管鳞癌组织中表达上调，在乳腺癌组织中也存在lncRNA ZFHX4-AS1的表达上调,而且后续研究发现lncRNA ZFHX4-AS1通过Hippo信号通路在乳腺癌中发挥致癌基因的作用[23-24]。本研究结果表明，乳腺癌患者唾液中ZFHX4蛋白水平显著上升，说明唾液ZFHX4蛋白与lncRNA ZFHX4-AS1表达趋势一致，推测唾液ZFHX4蛋白可以作为乳腺癌潜在预测因子。

进一步的生物信息学研究发现，TF和α2M具有相互作用，还与多个蛋白具有相互作用。STRING数据库分析发现，TF和α2M具有相互作用，TF是一个核心蛋白，还与多个蛋白具有相互作用。KEGG数据库分析发现，TF存在于HIF-1信号通路上，该通路在细胞生长发育和生理应激以及肿瘤的发生发展过程中具有重要作用。这提示唾液中TF、ZFHX4、ITIH1和α2M等4个蛋白均有可能成为乳腺癌潜在生物标志物，为乳腺癌的检测提供更简单快速的检测方法。

总之，本研究预示着唾液检测有可能成为一种可行的、优势明显的检测方法。但目前唾液检测尚处于初步阶段，唾液成分的稳定性以及受哪些因素的影响等尚不十分清楚，怎样控制唾液标本的稳定性以及怎样取材等需进一步探索研究。同时本研究结果需要进一步在大样本研究中验证，并对差异蛋白的结构、功能和作用机制加以深入研究。