甲基磺酸乙酯对穿心莲种子成苗的影响

2020-11-10蔡时可王继华

广东农业科学 2020年9期

周芳，梅瑜，顾艳，蔡时可，王继华

（广东省农业科学院作物研究所/广东省农作物遗传与改良重点实验室，广东广州 510640）

【研究意义】穿心莲〔Andrographis paniculata（Burm.F.）Nees〕为爵床科（Acanthaceae）穿心莲属（Andrographis）1年生草本植物，别名一见喜、苦草、印度草和橄榄莲等，是我国常用的大宗中药材之一，在东南亚国家也具有悠久的民间用药历史［1］。其性味苦、寒，归心、肺、大肠、膀胱经，主要药用成分为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯等二萜内酯类化合物，具有抗菌消炎、清热解毒和消肿止痛等功效，临床多应用于呼吸道感染、肠胃炎、糖尿病和高血压等心血管疾病的治疗，被称为“中药抗生素”［2-6］。穿心莲是利胆消炎片、注射液的主要原料，也是重要的中兽药主要成分，广泛应用于畜禽养殖业，其药用市场前景广阔，具有良好的发展潜力［7-10］。【前人研究进展】目前在穿心莲突变体创制上主要的诱变技术包括航天诱变、物理诱变和化学诱变［11-12］。其中，化学诱变成本低、操作简单，但通过人工方法产生常规育种中难以获得新性状，对植物品种的定向改良和新种质资源的创制具有重要作用，在植物育种和基因功能研究中应用广泛［13-14］。在穿心莲种子诱变研究中，0.075%秋水仙碱诱导穿心莲种子24 h，获得的同源四倍体无菌苗的上、叶下表皮气孔特征与二倍体无菌苗相比均存在显著性差异［15］。大气压等离子体处理穿心莲种子，可产生突变植株并且突变率和种子的含水量相关［16］。甲基磺酸乙酯（EMS）是常用的植物化学诱变剂，具有诱变频率高、点突变多、变异类型丰富和易操作等优点，被广泛用于植物育种和分子生物学研究［14-17］。EMS诱变技术在农作物上的应用较为成熟，在蔬菜、粮食作物和花卉上较多，获得具有农艺和品质性状丰富的突变类型后代群体，如耐湿性甘蓝型油菜突变体［18-19］。【本研究切入点】作为药用植物，穿心莲闭花受精的生物学特性阻碍了群体内遗传多样性的发生，种质资源遗传背景较窄，传统杂交育种相对受限［20-21］。利用各种基因突变技术创制新的种质资源逐渐受到青睐。目前，EMS诱变技术在中草药方面的研究相对较少，诱导穿心莲突变体的研究未见报道。穿心莲EMS诱变研究可以丰富诱变育种材料并加快育种进程、提升育种水平、创新优良品种、保障野生中药材资源的可持续利用。【拟解决的关键问题】通过比较分析EMS溶液的不同浓度和处理时间对种子萌发及幼苗生长过程的影响，获得穿心莲突变体库建立的最优条件，建立稳定的穿心莲EMS诱变技术；并对诱变后表型有差异的植株进行形态学方面的评价与鉴定，获得突变表型丰富的突变体库，为穿心莲在功能基因组学方面的研究及新种质选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

穿心莲种子为河北省农林科学院温春秀研究员提供，为福建漳州生产用种。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理将穿心莲种子置于1%洗洁精溶液中完全浸泡，超声波清洗处理60 min。清洁完毕后用自来水清洗数遍，再用自来水浸泡处理12 h，取出用纱布擦干穿心莲种子表面的水分。将预处理好的种子放入质量分数0.5%、0.8%的EMS溶液中，恒温振荡培养4、8、12 h。于2019 年10月种植于泥炭土和珍珠岩配比为3∶1的培养土，置于温度26℃、湿度80%培养箱中培养。以未经EMS处理的穿心莲种子萌发的幼苗为对照。

1.2.2 种子发芽与幼苗指标调查 2020年3月，对植株的表型进行观察统计。

株高：穿心莲种子播后35 d，测量幼苗株高，每个处理4次重复，每个重复50株，选对角线5株测量株高。

1.2.3 数据统计分析数据采用IBM SPSS（Version 19.0）分析软件进行统计学分析，运用LSD（Least-Significant Difference）最小显著性差异法进行多重比较，该方法由英国统计学家Fisher 提出，对两个或多个样本平均数差异显著性检验，具有敏感性高的优点。

2 结果与分析

2.1 EMS对穿心莲种子萌发的影响

2.1.1 对种子发芽率的影响穿心莲种子发芽较为缓慢，随着播种时间延长，发芽率逐渐升高，播种6 d后，每隔2 d统计1次。发芽高峰在播种后10 d左右，发芽率在37.50%～64.50%。其中，0.8%EMS处理4 h的种子在播种14 d时发芽率最高，达到80.00%；而处理8 h的最低，播种14 d时仅为50.50%。对照种子在播种后6～8 d才开始发芽。低EMS浓度、短处理时间的种子发芽早，发芽率高于对照，随着EMS处理时间延长和处理浓度升高，发芽率随之降低，呈负相关，且EMS浓度比处理时间对种子萌发的抑制作用明显（表1）。

2.1.2 对幼苗生长的影响对播种22 d成活的幼苗数进行调查统计，其成苗率和相对成苗率见表2。同一浓度下，穿心莲的成苗率和相对成苗率随EMS处理时间延长总体呈负相关。其中，EMS浓度为0.5%、处理12 h的种子成苗率和相对成苗率最低。EMS浓度为0.8%、处理4 h种子的成苗率和相对成苗率显著高于对照。几种处理方式对穿心莲种子的成苗率和相对成苗率均表现出不同程度的影响。EMS浓度为0.5%、处理8 h的成苗率高于其他两个处理时间，但差异不显著。处理时间为4 h的两个不同浓度处理，株高和对照相比均无显著差异。随着EMS浓度增加和处理时间延长，穿心莲幼苗植株高度下降，和对照、处理4 h的株高存在显著差异。可见，EMS对穿心莲幼苗生长的影响优先表现在对植株生长高度的抑制，且EMS浓度提高和处理时间延长抑制幼苗的前期生长。

2.2 穿心莲突变类型鉴定

对EMS诱变的穿心莲植株群体在生物学和形态学方面的性状进行调查，发现一些突变植株在叶型、叶色、叶序、株高、株型和花轴等形态上与正常植株（图1A、E）表现出明显差异。（1）叶部突变（图1B、C、D）。与对照相比，经EMS处理的穿心莲表现出淡黄杂斑叶、单片叶色加深或者一叶对称两色等变异，可能与EMS参与促进或抑制叶绿素的合成有关。叶型上出现较多叶裂、心形叶等，随着植株生长，这些变异叶片出现死亡，部分可恢复正常生长。主茎叶序出现由正常株的单叶对生变异为单叶轮生，且轮生叶随着植株的生长依然保持稳定的轮生叶序。（2）花轴变异（图1F、G）。由对生叶变异为轮生叶的植株，其轮生叶的叶腋处均可抽出花轴，形成轮生型花轴。此外，在诱变的植株中还发现多株无花序轴型植株，其小花花柄直接着生于主茎或分枝上。（3）株型突变（图1H）。在EMS诱变种子长成的植株群体中，其株型也出现较多变异，对比正常株型，少数诱变植株出现矮化型、节间缩短等特异株型。（4）分枝（图1I）。正常的穿心莲植株从主茎的对生叶腋处抽出分支，诱变的分株从底部直接产生分枝，形成两个以上主茎。（5）物候期突变：经EMS诱导处理的穿心莲植株，大多与对照保持一致的花期和生长速率，少数突变体在开花期没有开花，甚至无花轴抽出。

表1 不同EMS处理条件对穿心莲发芽率的影响Table 1 Effects of different EMS treatment conditions on the germination rates of Andrographis paniculata

表2 不同EMS处理条件对穿心莲幼苗生长的影响Table 2 Effects of different EMS treatment conditions on the growth of Andrographis paniculata seedlings

图1 穿心莲EMS诱导变异类型Fig.1 Variation types of Andrographis paniculata induced by EMS

2.2.1 EMS处理诱导的变异率从表3可以看出，0.5%、0.8%两种浓度的EMS处理4 h，均不能产生突变体植株。但随着处理时间延长，突变率上升。其中0.5%EMS处理 12 h诱变率最高（3.5%），适量延长处理时间可提高穿心莲种子的诱变率。

表3 不同EMS处理诱导穿心莲的诱变率Table 3 Mutagenesis rates of Andrographis Paniculata induced by different EMS treatments

3 讨论

穿心莲是我国重要的中药材之一，但存在生物学特性不一致和品种混杂退化等现象。穿心莲易受生长环境、栽培条件、加工处理等因素影响，产量和质量不稳定，选育抗逆性强、产量高、有效成分高的优良品种是穿心莲产业发展的基础。由于穿心莲是国外引入物种，且引入时间不长，分布区域有限，种质资源匮乏，因而穿心莲的良种选育成为亟待解决的问题。目前，突破穿心莲育种瓶颈、创新穿心莲种质是进行穿心莲品种改良的基础，诱变是重要创新途径之一［22］。同时获得具有特异发育表型的突变体材料对于开展植物基因功能研究具有重要意义［23］。EMS诱导是目前生产运用较多的一种突变体制备方法，具有突变率高、操作易控、基因组损伤小、经济实用等特点，逐渐成为获得大量突变体样本的优势技术［24-26］。不同品种穿心莲的蜡质层以及内含的发芽抑制物有一定差异，可能和穿心莲品种特性密切相关。本研究中穿心莲种子发芽率均不高，最高仅为80%，可能与穿心莲表面有蜡质层、种皮致密且坚硬、内含有发芽抑制物且存在外致性和生理性休眠有关［27］。对穿心莲种子进行EMS诱导应根据其品种特性，基于种子的半数致死剂量进一步优化最适宜穿心莲的诱变条件［28-29］。

本研究发现了一些无花轴的穿心莲突变体植株和生殖生长阶段延迟的突变体植株，可能是EMS对其生殖器官的形成（花等）或在生殖生长过程中产生一定抑制作用，后期需进一步进行相关方面的研究论证。在幼苗阶段，诱变植株的叶色和叶片形状出现多种变异，随植株不断生长，叶片颜色的部分突变性状逐渐消失，表型不再明显，和紫花苜蓿等在EMS诱变中出现的现象相似［29］。这可能是随着植株生长而逐渐消除EMS对叶片颜色产生的影响，具体原因有待进一步解析，也将是我们后期研究的重要关注点之一。EMS诱导为穿心莲的诱变育种和功能基因组研究可提供表型丰富的遗传材料，对穿心莲新品种选育提供新的材料。