槟榔芋软腐病生防真菌的筛选

董晓菲 叶祖云 刘雨虹 黄林榕 李珊

摘要：[目的]以福鼎槟榔芋为研究对象筛选生防菌株，为槟榔芋软腐病生物防治提供可用菌株。[方法]从福鼎槟榔芋根际土壤和健康植株球茎内分离得到12株真菌，经离体球茎试验筛选，共筛选出9株对槟榔芋软腐病具有防治效果的真菌菌株。对这9株菌株进行分子鉴定、常规形态特征观察、生理生化测定和田间活体防效等，进一步筛选可用菌株。[结果]得到2株有较好防治效果的菌株CAF-H001和CAF-L002.扩增菌株的ITSl/ITS4DNA，经测序后与NCBI数据库进行同源性比对，结果显示菌株CAF-H001与藤仓镰刀菌（Fusariumfujikuroi）相似度100%，菌株CAF-L002与塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）相似度100%。其中，菌株CAF-H001为白色菌体，细长型分生孢子，最适pH为9，最适温度为28℃，以淀粉作为碳源、蛋白胨作为氮源时生长最佳;菌株CAF-L002为黑褐色菌体，球形分生孢子，最适pH为8，最适温度为32℃，以淀粉作为碳源、酵母浸粉作为氮源时生长最佳。[结论]本研究分离鉴定的菌株CAF-H001和CAF-L002分别为藤仓镰刀菌和塔宾曲霉，具有较好的生防应用价值，为槟榔芋软腐病的生物防治提供了基础。

关键词：槟榔芋;软腐病;生物防治

中图分类号：S436.32文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）05-0538-07

0 引言

（研究意义）槟榔芋（Colocasia esculenta L var.coFmos～Is Chang）属天南星科多年生单子叶宿根性草本植物，营养丰富，有较高的市场价值。2011年11月22日，中华人民共和国农业部批准对“福鼎槟榔芋”实施农产品地理标志登记保护。目前槟榔芋产业已成为福建省福鼎县农业增收的支柱产业，种植面积超过2000hm²，产值逾3亿元。软腐病是影响槟榔芋产量的最主要因素之一，株发病率一般为3%～15%，严重时超过50%甚至绝收，非常挫伤芋农积极性。软腐病菌为细菌，多在槟榔芋球茎或叶柄基部发病，病菌于土壤或球茎中越冬，通过伤口、气孔侵入，经昆虫接触或灌溉流水蔓延造成再次侵染，25-30℃时最易发病，暴风雨、高温高湿、连作地等极易传播，发病严重，对槟榔芋的产量和当地经济造成巨大影响，且用轮作、化学杀菌剂等方式防治收效甚微、作用时间短，化学防治方法易产生环境安全和食品安全的隐患。（前人研究进展）生物防治高效且无毒，可有效保留环境里的有益微生物，符合人们对绿色食品的需求，且利于农业的可持续发展。利用有益微生物可有效控制病害，目前已有对黄瓜、柑橘、甜瓜等作物的病害进行微生物防治的研究。周丽洪等分离鉴定了3株内生菌对魔芋细菌性软腐病具有显著防控作用的生防菌株，其田间生物防治效果可达57%～79%。目前槟榔芋软腐病的防治主要采取综合防治技术，即农业栽培、物理人工、化学药剂防治相结合，偏向于防重于治。（本研究切入点）关于槟榔芋软腐病生物防治方面的研究尚比较缺乏。（拟解决的关键问题）本试验在前期分离鉴定软腐病病原菌的基础上进一步筛选生防菌株，探究其作用效果和使用方法，以期为槟榔芋软腐病的防治提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品：土样和健康槟榔芋球茎均采自福建省福鼎市贯岭镇河坑村槟榔芋种植田地（120°1144"E，27°22′16”N），选取不同种植地块，在地块靠中心处，用高温灭菌过的小铲和剪刀进行取样，其中土样取深度10～15cm的健康槟榔芋植株根际土壤3处各200g，健康槟榔芋球茎5棵，分别装入自封袋并做标记，放人装有冰袋的泡沫箱中带回实验室4℃保存，并于3天内使用。槟榔芋软腐病病原细菌来源于实验室前期分离鉴定菌株（菌株编号141108）。

主要试剂：PDA培养基，NA培养基，0.1%升汞，75%酒精，棉兰染液等。

仪器：生化培养箱（上海齐欣，KLH-250FD），PCR仪（德国，Biometra），超净工作台（苏州净化，SW-CJ-2D），电泳仪（北京六一，DYY-10C），超纯水器（香港力康，Easyl5），高压灭菌锅（美国致微，GR60-DA），生物显微镜（宁波舜宇，E5）等。

1.2 试验方法

1.2.1真菌的分离纯化 参考方中达的方法。土壤分离真菌：称取10g土壤放人盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡10min，依次稀释成10^-1、10^-2、10^-3、10^-1、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的稀释液。分别吸取上述稀释液100uL均匀涂于PDA培养基平板上，每个浓度梯度涂3皿，于28℃恒温箱倒置培养3～5d，每天观察生长情况。内生菌分离真菌：将健康的槟榔芋球茎洗净后切取成5×5×5cm组织块，75%酒精浸泡1min，无菌水漂洗，再用0.1%升汞表面消毒1-2min，用无菌水冲洗3次后晾干。用无菌刀将表面消毒后的组织块切成约0.5×0.5×0.5cm的小块，分别置于无菌研钵中加5mL无菌水研磨成浆状，静置10min，将组织研磨液梯度稀释10～1000倍，分别取100uL涂布到PDA培养基平板上，每个稀释度涂布3皿，于28℃恒温箱倒置培养3～5d，每天观察生长情况。待长出菌落后，根据菌落形态、颜色等性状将不同的单菌落挑出，采用平板划线法在PDA培养基上进行分离纯化，纯化2～3次，直至分离出单菌落，于斜面试管4℃冰箱保藏。

1.2.2生防菌的离体球茎筛选 参考陈娇梅等的方法略有改动。将分离纯化的真菌和软腐病病原细菌分别接种于PDA、NA液体培养基中，真菌于28℃、220r·min^-1摇床培养3d，病原细菌于37℃、220r·min^-1摇床培养8h，备用。选取健康槟榔芋球茎，洗净并风干后，切取大小为长3cm×3cm×0.7cm的組织块，75%酒精消毒30s后用0.1%升汞液消毒5min，无菌水充分涤荡5次，再放人有滤纸的无菌培养皿中，每皿放人一组织块，备用。将软腐病病原菌液和待测真菌液以1：1比例混合，用无菌刀和镊子在处理的组织块中央划长1cm、宽1cm、深约0.3cm的十字伤口，接种20uL混合菌液于组织块十字中央。以无菌水接种为阴性对照，软腐病病原菌液接种为阳性对照，每个真菌处理重复3皿，置于28℃恒温培养箱培养14d，观察记录并拍照。