铁皮石斛鲨烯单加氧酶基因的克隆与表达分析

林江波 王伟英 邹晖 戴艺民

摘要：[目的]克隆铁皮石斛（Dendrobium officinale）甾醇类化合物合成关键酶鲨烯单加氧酶（SqualeneMonooxygenase，SQE）基因，并对其进行生物信息学分析和不同营养生长期茎和叶中的表达模式分析。[方法]根据铁皮石斛转录组测序获得带5末端的SQE基因片段，设计DoSQEI与DoSQE2基因的3RACE引物，克隆全长eDNA，利用生物信息学分析软件对DoSQEl与DoSQE2基因及其编码蛋白序列进行分析。运用实时荧光定量PCR检测DoSQEl与DoSQE2基因在铁皮石斛营养生长期的8月、10月、12月茎和叶中的表达模式。[结果]DoSQEl基因cDNA序列全长1796bp（GenBank登录号MTl60182），含有1个1554bp的ORF，编码517个氨基酸;DoSQE2基因cDNA序列全长1963bp（GenBank登录号MTl60183），含有1个1578bp的ORF，编码525个氨基酸。DoSQEl具有2个跨膜区，分别在4～22aa和55～72aa;DoSQE2只有在5～13aa的1个跨膜区。DoSQEl蛋白在204～476aa、DoSQE2蛋白在211～484aa处含有鲨烯环氧酶结构域。系统进化分析表明，DoSQEl与姬蝴蝶兰SQE（XP020599860.1）的亲缘关系最近，DoSQE2与姬蝴蝶兰SQE（XP 020579136.1）的亲缘关系最近。qRT-PCR检测结果表明，茎和叶中都能检测到2个基因的表达，叶的表达量显著高于茎。DoSQEl基因在8月份表达量最高，DoSQE2基因在10月份表达量最高。[结论]本研究克隆得到DoSQEl和DoSQE2基因，发现DoSQEl和DoSQE2基因的表达模式存在差异，该结果为进一步研究铁皮石斛甾醇类化合物生物合成机理及代谢调控奠定基础。

关键词：铁皮石斛;鲨烯单加氧酶;生物信息学分析;荧光定量PCR

中图分类号：s567.239文献标志码：A 文章编号：1008-0384（2020）05-0495-08

0 引言

（研究意义）植物甾醇是一类生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、预防和治疗心脑血管疾病等作用。铁皮石斛（Dendrobium officinale）是名贵中药材，具有增强免疫力、降血糖和抗肿瘤等生理活性。已有研究表明铁皮石斛含有豆甾醇、β谷甾醇、γ-谷甾醇和油菜甾醇等植物甾醇类次生代谢产物。鲨烯单加氧酶（SqualeneMonooxygenase，SQE）又称鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase，SE），催化角鲨烯生成2，3-氧化鲨烯。环阿屯醇合酶（Cycloartenolsynthase，CAS）催化2，3-氧化鲨烯形成环阿屯醇，代谢流向植物甾醇;羽扇豆醇合成酶（Lupeolsynthase，LS）、β-香树脂醇合成酶（β-amyrin synthase，β-AS）和达玛烯二醇合成酶（Dammarenediol synthase，DS）催化2，3-氧化鲨烯形成羽扇豆醇、β-香树脂醇和达玛烯二醇，代谢转向三萜类生物合成通道。因此，SQE是植物甾醇和三萜类物质合成途径的一个关键限速酶。开展铁皮石斛SQE基因的克隆及表达模式分析，对探讨铁皮石斛植物甾醇生物合成分子机制及代谢调控具有重要的意义。（前人研究进展）孙蓉等克隆了金龙胆草（Conyza blinii h.Lev）CbSQE基因，编码525个氨基酸，构建了原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达。祝传书等克隆了雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.f.）TwSEl和TwSE2基因，具76.18%相似性，TwSEl基因在花中表达量最高，TwSE2基因在花和嫩叶中的表达量最高，均受MeJA诱导上调表达，上调幅度TwSEl基因高于TwSE2基因。王学方等对17种大戟科（Euphorbiaceae）植物的SE分析发现只有蓖麻（Ricinus communis）4和木薯（Manihot esculenta）l的SQE具有信号肽;5个没有跨膜结构域，7个只在N末端有跨膜结构域，5个N末端和C末端都有跨膜结构域。此外，在人参（Panaxginseng）、绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）、野三七（Panaxvietnamensisvar.fuscidiscus）、金鐵锁（Psammosilenetunicoides）等药用植物也开展了SQE基因的克隆研究。（本研究切入点）目前，未见铁皮石斛SQE基因的相关研究报道。（拟解决的关键问题）本课题组通过铁皮石斛茎和叶的转录组测序，分析了植物甾醇的生物合成途径相关基因，获得2个带5末端的SQE基因片段，以此为基础开展全长cDNA及ORF克隆和表达模式分析。本研究通过已获得2个带5末端的SQE基因片段设计3RACE引物，克隆基因全长cDNA序列和ORF，并分析2个基因在不同营养生长期铁皮石斛茎和叶中的表达模式，以期为进一步研究铁皮石斛SQE基因功能及植物甾醇生物合成分子机制和代谢调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

植物材料为福建冠豸山种源铁皮石斛，2017年种于亚热带农业研究所温室大棚，基质为松树皮，光照强度8000～10000lX，空气相对湿度70%～90%。于不同营养生长期（2018年8月、10月、12月）取铁皮石斛的茎和叶，每个样品3重复，超低温冰箱-80℃保存，用于RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 总RNA提取和cDNA合成 按照TaKaRa的RNAiso Plus说明提取铁皮石斛茎、叶的总RNA，检测RNA的质量和浓度。以提取的总RNA为模板，随机引物逆转录合成eDNA第1链。

1.2.2DoSQEl与DoSQE2基因全长cDNA的克隆根据已经获得的DoSQEl与DoSQE2基因信息设计用于3'RACE的引物及接头引物（表1）。取8月、10月、12月铁皮石斛茎和叶的cDNA各lO uL混合作为模板，用引物3DoSQElFl和dT-adaptor、3DoSQE2Fl和dT-adaptor分别进行PCr.把PCR产物稀释10倍作为模板，3DoSQElF2和adaptor、3DoSQE2F2和adaptor进行巢式PCr.反应体系25uL：ddH₂O 8.5uL，上下游引物（10umol·L^-1）各1uL，2×SanTaqPCRMix 12.5uL，模板2ul.PCR反应程序为94℃预变性5min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环，最后72℃延伸lo min.PCR产物经电泳检测后，胶回收目的片段，与pMDl9-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，复苏后涂LB平板（含100mg·L^-1氨苄青霉素），选择经菌落PCR鉴定的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.2.3DoSQEl与DoSQE2基因ORF的克隆根据DoSQEl与DoSQE2基因全长cDNA序列设计DoSQEl基因的ORF克隆引物DoSQElF（带Xpn I酶切位点）与DoSQElR（带SalI酶切位点）和DoSQE2基因的ORF克隆引物DoSQE2F（带Kpn Ⅰ酶切位点）与DoSQE2R（带SalⅠ酶切位点），产物长度分别为1579bp和1645bp（表1）。以2uL混合的cDNA为模板，PCR扩增体系和反应程序同上，延伸时间90s.阳性克隆送去测序。

1.2.4DoSQEl与DoSQE2基因的生物信息学分析

ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）分析DoSQE/与DoSQE2基因编码蛋白的理化性质，蛋白跨膜区预测利用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/），二级和三级结构预测使用在线工具SSPro（http：//scratch.proteomics.ics.uci.edu/）和SWISS-MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）。采用NCBI的BLASTP搜索DoSQEl与DoSQE2基因编码蛋白的同源序列及保守结构域，通过MEGA6.0（Neighbor Joining Tree，Bootstrap 1000）构建系统进化树。

1.2.5DoSQEl与DoSQE2基因的表达分析设计DoSQEl基因引物DoSQEl-F和DoSQEl-R、DoSQE2基因引物DoSQE2-F和DoSQE2-R、内参Actin基因引物DoACT-F和DoACT-R（表1）用于荧光定量PCr.把不同月份茎和叶的cDNA浓度定量为200ng·uL^-1。用Roche LightCycler 96检测DoSQEl与DoSQE2基因在不同生长期铁皮石斛茎和叶中的表达量。反应体系为：TB Greena Premix Ex Tap Ⅱ（TliRNaseHPlus）10uL，上、下游引物各l uL，cDNA模板2uL，ddH₂O补足20ul.反应程序为：95℃30s;95℃10s，60℃ 20s，45个循环;每个反应设置3个重复。利用2^△△CT法分析相对表达量，DPS数据处理软件对结果进行方差分析，多重比较采用新复极差法（Duncan法）。

2 结果与分析

2.1 DoSQEl与DoSQE2基因全长cDNA的克隆

以不同生长期茎和叶的cDNA混合物作为模板，利用3RACE引物进行巢式PCR扩增DoSQEl与DoSQE2基因3末端，DoSQEl与DoSQE2基因分别得到l条特异条带，约800bp和680bp（图1-A、C），目的条带经过胶回收、连接、转化和克隆验证后送去测序、测序结果利用DNAMAN V6.0进行序列拼接及ORF预测，获得DoSQEl基因cDNA序列全长1796bp（GenBank登录号MTl60182），含有1个1554bp的ORF，编码517个氨基酸，5末端非翻译区24bp，3末端非翻译区218bp;DoSQE2基因cDNA序列全长1963bp（GenBank登录号MTl60183），含有1个1578bp的ORF，编码525个氨基酸，5末端非翻译区127bp，3末端非翻译区258bp.

2.2DoSQEl与DoSQE2基因开放阅读框的克隆

以不同生长期茎和叶的cDNA混合物作为模板，利用扩增ORF的引物扩增DoSQEl与DoSQE2基因的ORF，电泳结果显示，DoSQEl与DoSQE2基因分别得到1条约1579bp和1645bp的特異条带（图1-B、D），大小与预测一致。PCR产物经过克隆及验证后送去测序，测序结果经DNAMAN V6.0比对，结果表明获得了DoSQEl与DoSQE2基因ORF，核苷酸序列相似度为79.78%，编码氨基酸相似度为80.95%。提取阳性克隆的质粒pMDl9-T-DoSQEl和pMDl9-T-DoSQE2超低温冰箱保存。

2.3DoSQEl与DoSQE2蛋白基本性质分析

利用ProtParam tool在线分析DoSQEl与DoSQE2蛋白的理化性质。结果表明，DoSQEl蛋白的分子量为56.235kD，理论等电点为8.96，负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为45，正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为55，不稳定系数是44.92，总平均疏水性是0.084，属于一种不稳定的疏水性蛋白。DoSQE2蛋白的分子量为56.541kD，理论等电点为8.77，负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为46，正电荷的氨基酸残基数（Arg+LVs）为53，不稳定系数是39.66，总平均疏水性是0.137，属于一种稳定的疏水性蛋白。使用TMHMM Server v.2.0预测DoSQEl与DoSQE2蛋白跨膜区，结果显示（图2），DoSQEl具有2个跨膜区，分别在4～22aa和55～72aa;DoSQE2只有1个跨膜区，在5～23aa.DoSQEl蛋白在204～4768a、DoSQE2蛋白在211～4848a处含有鲨烯环氧酶结构域，E值分别为1.32×10^-157和3.04X10^-154。

2.4DoSQEl与DoSQE2蛋白空间结构分析

SSPro在线预测DoSQEl与DoSQE2蛋白二级结构结果（图3）表明，DoSQEl和DoSQE2形成无规则卷曲氨基酸残基分别有207（40%）和231（44%）个，形成α螺旋氨基酸残基分别为232（44.9%）个和216（41.1%）个，形成β折叠氨基酸残基都是78个，分别占15.1%和14.9%。通过SWISS-MODEL在线预测，DoSQEl与DoSQE2蛋白3D结构如图4，同源建模的模板都是6c6n.1.A，一致性分别为48.07%和47.37%，建模范围在51～496和78～504位氨基酸残基，覆盖率85%和80%。

2.5DoSQEl与DoSQE2蛋白同源性系统进化分析

使用BLASTP检索DoSQEl与DoSQE2蛋白的同源序列，结果表明：DoSQEl蛋白的氨基酸与姬蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris，XP 020599860.1）、高粱（Sorghum bicolor，XP 002468222.1）和油棕（Elaeisguineensis，XP 010936193.1）SQE氨基酸序列的相似度分别为86%、85%和84%。DoSQE2蛋白的氨基酸与姬蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris，XP 020579136.1）、小米（Setaria itaBca，XP 004985122.1）和玉米（Zeamays，ONL95392.1）SQE氨基酸序列的相似度分别为87%、86%和86%。将DoSQEl与DoSQE2蛋白的氨基酸序列与其他15个物种的SQE氨基酸序列进行系统进化分析，结果（图5）显示，兰科植物的铁皮石斛和姬蝴蝶兰聚为一类，DoSQEl与姬蝴蝶兰的XP 020599860.1亲缘关系最近，DoSQE2与姬蝴蝶兰的XP 020579136.1亲缘关系最近。

2.6DoSQEl与DoSQE2基因表达分析

利用qRT-PCR检测DoSQEl和DoSQE2基因在铁皮石斛茎和叶中的表达模式，结果（图6）表明，茎和叶中都能检测到2个基因的表达，相同时间叶的表达量显著高于茎。DoSQEl基因在铁皮石斛茎和叶中的表达量8月份最高，lo月份次之，12月份最低。DoSQE2基因在铁皮石斛茎和叶中的表达量10月份最高，8月份次之，12月份最低。

3 讨论与结论

鲨烯单加氧酶是三萜类和甾醇类化合物生物合成关键酶。本研究克隆了铁皮石斛DoSQEl和DoSQE2基因，核苷酸序列相似度为79.78%，编码氨基酸相似度为80.95%，含有鲨烯环氧酶结构域。DoSQEl与野三七的PvfSE一样具有2个跨膜区;DoSQE2与雷公藤的TwSE2一样仅有1个跨膜区。由于DoSQEl和DoSQE2跨膜区个数不同，推测蛋白在膜内和膜外的结构不一样，催化活性也存在差异。

不同植物具有不同的SQE基因拷贝数，不同SQE基因组织表达模式也具有差异。雷公藤TwSEl基因表达量最高的是花，最低的是根;TwSE2基因表达量最高的是花和嫩叶，最低的是老叶。DEVARENNE等研究发现，提高或降低SQE基因的表达量，三萜皂苷的生成量也随之增加或减少。CHOI等研究表明，茉莉酸甲酯（MeJA）诱导提高SQE基因的表达，增加了三萜的合成量。铁皮石斛DoSQEI和DoSQE2基因在茎和叶都有表达，叶的表达量显著高于茎。DoSQEl基因从8月份到12月份表达量逐渐降低。DoSQE2基因表达量从8月份到12月份是先升高后降低。DoSQEl和DoSQE2基因表达模式不同，推测两者在铁皮石斛营养生长过程的催化活性存在差异。

本研究克隆了铁皮石斛DoSQEl和DoSQE2基因，分析了营养生长期的表达模式，为進一步研究其在铁皮石斛甾醇类化合物生物合成中的功能奠定基础。