当归芍药散对肾病综合征幼鼠足细胞肌动蛋白骨架的保护作用

2020-11-09张天照

中国医学创新 2020年22期

张天照

【摘要】目的：探讨当归芍药散对肾病综合征幼鼠足细胞肌动蛋白骨架的保护作用。方法：选取4周龄幼鼠40只，按随机数字表法分为空白组、模型组、坎地沙坦组及中药组，每组10只。模型组、坎地沙坦组及中药组通过阿霉素尾静脉注射建立肾病综合征模型，造模成功后中药组予以当归芍药散水煎浓缩剂灌胃，坎地沙坦组予以坎地沙坦酯片混悬液灌胃，空白组与模型组予以0.9%氯化钠溶液灌胃。灌胃4周后比较四组一般状态、体重、24 h尿蛋白、血清白蛋白水平，电镜观测肾小球足细胞损伤情况，比较四组RANK、RANKL、α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表达情况。结果：干预后，模型组一般状态差、眼睑可见水肿。中药组与坎地沙坦组一般状态均略优于模型组。干预后，模型组、中药组及坎地沙坦组体重与血清白蛋白水平低于空白组，而24 h尿蛋白高于空白组（P<0.05）。中药组与坎地沙坦组体重与血清白蛋白均高于模型组，而24 h尿蛋白均低于模型组（P<0.05）。干预后，模型组、中药组及坎地沙坦组RANK、RANKL mRNA相对表达量均高于空白组，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相对表达量均低于空白组（P<0.05）。中药组及坎地沙坦组RANK、RANKL mRNA相对表达量均低于模型组，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相对表达量均高于模型组（P<0.05）。模型组电镜下可见足突融合，足细胞结构破坏。中药组及坎地沙坦组足突融合程度较轻，可见少量完好足细胞。结论：当归芍药散对肾病综合征幼鼠具有一定的治疗作用，这种作用可能是通过改善其肾脏RANK、RANKL、α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表達来实现的。

【关键词】当归芍药散肾病综合征足细胞肌动蛋白骨架

Protective Effect of Danggui Shaoyao Powder on Podocyte Actin Skeleton in Young Rats with Nephrotic Syndrome/ZHANG Tianzhao. //Medical Innovation of China， 2020， 17（22）： 00-005

[Abstract] Objective： To investigate the protective effect of Danggui Shaoyao Powder on podocyte actin skeleton in young rats with nephrotic syndrome. Method： A total of 40 rats aged 4 weeks were selected. They were divided into blank group， model group， Candesartan group and Chinese medicine group according to the random number table method， with 10 rats in each group. Nephrotic syndrome model was established by intravenous injection of Adriamycin in the model group， Candesartan group and Chinese medicine group. After the success of the building， the Chinese medicine group was gavaged with Danggui Shaoyao powder decoction concentrate， the Candesartan group was gavaged with suspension of Candesartan tablets， the blank group and model group were gavaged with 0.9% sodium chloride solution. After 4 weeks of gavage， the general status， body weight， 24 h urinary protein and serum albumin level of the four groups were compared. The damage of glomerular podocyte were observed by electron microscopy， the expressions of RANK， RANKL， α-actinin-4 and Synaptopodin mRNA of the four groups were compared. Result： After intervention， the general state of the model group was poor with eyelid edema. The general state of the Chinese medicine group and Candesartan group were slightly better than that of the model group. After intervention， the body weight and serum albumin levels of the model group， Chinese medicine group and Candesartan group were lower than those of the blank group， while the 24 h urine protein were higher than that of the blank group （P<0.05）. The weight and serum albumin of the Chinese medicine group and the Candesartan group were higher than those of the model group， while the 24 h urine protein were lower than those of the model group （P<0.05）. After intervention， the mRNA relative expression levels of RANK and RANKL in the model group， Chinese medicine group and Candisartan group were higher than those in the blank group， while the mRNA relative expression levels of α-actinin-4 and Synaptopodin were lower than those in the blank group （P<0.05）. The mRNA relative expression levels of RANK and RANKL in the Chinese medicine group and Candesartan group were lower than those in the model group， while the mRNA relative expression levels of α-actinin-4 and Synaptopodin were higher than those in the model group （P<0.05）. The fusion of podocyte and the destruction of podocyte structure were observed under electron microscope in the model group. The fusion degree of podocyte in the Chinese medicine group and Candesartan group were relatively light， and a few intact podocyte cells could be seen. Conclusion： Danggui Shaoyao powder has a certain therapeutic effect on young rats with nephrotic syndrome. This effect may be achieved by improving the expression of RANK， RANKL， α-actinin-4， and Synaptopodin mRNA in the kidney.

[Key words] Danggui Shaoyao Powder Nephrotic syndrome Podocyte Actin skeleton

First-authors address： Heilongjiang Traditional Chinese Medicine Hospital， Harbin 150036， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2020.22.001

小儿肾病综合征（nephrotic syndrome，NS）多由感染、免疫力低下引起，其发病有逐年上升趋势[1]。小儿NS主要症状为大量蛋白尿、水肿、低蛋白血症等，其肾脏病理多为微小病变型改变，以肾小球足细胞损伤为主，足细胞的结构主要由肌动蛋白骨架支撑，该结构的破坏导致足细胞滤过屏障功能减弱，从而出现蛋白尿等一系列症状[2]。西医治疗NS主要以降低肾小球内压、皮质激素、免疫抑制剂等方案为主，虽有疗效但副作用较大。当归芍药散出自《金匮要略》，具有养血调肝，健脾利湿之功效，原文中提到其主治妇人妊娠或经期腹痛头晕或下肢浮肿，现代医家依据异病同治理论，以之治疗多种疾病[3]。笔者以當归芍药散治疗小儿肾病综合征，效果较好，现通过动物实验深入研究其作用机理，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料（1）实验动物：本次实验自2019年5-7月，

选取购于黑龙江中医药大学实验动物中心的4周龄雄性SD大鼠，平均体重（208.42±8.36）g。

所有幼鼠常规饲养，定时通风，普通饲料，正常饮水，温度控制在（23.0±2.0）℃，湿度50%左右，氨浓度不高于20 ppm。垫料每

3天更换1次，饲养笼每3天清洗1次。（2）实验药物：治疗性药物均由本院药局提供，当归芍药散组成为当归9 g，芍药18 g，川芎24 g，茯苓12 g，泽泻24 g，炒白术12 g，药材切碎后以水浸泡40～60 min，煎煮3次取汁混合，恒温水浴浓缩得到总生药浓度为1.5 g/mL药液备用，坎地沙坦酯片购于重庆圣华曦药业，以蒸馏水制备为20 mg/mL混悬液备用。（3）实验试剂及仪器：阿霉素购自合肥巴斯夫，配制为1 mg/mL溶液2 ℃保存，水合氯醛来自青岛宇龙海藻，配置为10%溶液2 ℃保存;兔抗鼠RANK、RANKL购自美国CST公司;兔抗鼠β-actin、山羊抗兔IgG-HRP购自武汉三鹰生物技术有限公司;α-actinin-4抗体、Synaptopodin抗体购自北京博奥森生物技术有限公司;其余基础实验材料及器材均由实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及模型制备幼鼠适应性饲养3 d，按随机数字表法分为空白组、模型组、坎地沙坦组、中药组各10只。模型组、坎地沙坦组、中药组于实验第4天进行阿霉素造模，以6.5 mg/kg尾静脉注射，分为4.0 mg/kg、2.5 mg/kg两次给药，时间间隔1周[4]。造模操作如下：幼鼠提前12 h禁食不禁水，首先测量体重，根据体重计算阿霉素剂量，抽取药物至1 mL注射器中置于2 ℃环境备用，然后将幼鼠以固定器固定并暴露尾部，40 ℃温水浸泡鼠尾使鼠尾静脉充盈，用碘伏消毒鼠尾皮肤，先取内存0.9%氯化钠溶液的注射器自腹侧尾静脉远端的1/3处，15°角斜行进针，刺入血管后平行进针，回抽见血，证实针头在血管内，迅速换上含阿霉素注射液注射器缓慢推注。因阿霉素渗漏可导致幼鼠尾部组织腐烂，故推注过程中密切观察进针处，如有药液渗漏则立即停止给药，尽量将渗出药液挤出，然后更换位置重新进针给药，静注药物完毕后更换注射器推注0.1～0.2 mL 0.9%氯化钠溶液以冲净针头内药物，尾静脉注射液体总量不超过10 mL/kg体重。

1.2.2 给药方法 2次阿霉素给药完成后间隔1周开始给予治疗性药物，坎地沙坦组予以坎地沙坦酯片混悬液灌胃，中药组予以当归芍药散灌胃，给药剂量参考公式幼鼠剂量（g/kg）=儿童剂量（g/kg）×折算系数（6）[5]。将各鼠药物计算完成后，可将中药及西药溶液再次恒温浓缩至不超过2 mL，分为2次灌胃，空白组与模型组分别予以等体积0.9%氯化钠溶液灌胃，灌胃持续4周。

1.3 观察指标与判定标准灌胃4周后，将幼鼠禁食不禁水12 h，代谢笼留取幼鼠24 h尿，考马斯亮蓝法监测24 h尿蛋白定量。水合氯醛麻醉幼鼠，腹主动脉取血检测血清白蛋白水平。取血后取出幼鼠肾脏，组织学固定后，脱水包埋，电镜下观察足细胞损伤情况，以RT-PCR法检测肾脏RANK、RANKL、α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表达情况。

1.4 统计学处理采用SPSS 20.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 四组一般状态情况实验结束时各组幼鼠无死亡，空白组幼鼠一般状态正常，体重随发育而增长，其他均正常。模型组幼鼠精神萎靡，动作活泼性下降、食水量减少，皮毛光泽暗、眼睑及四肢末端可见水肿，耳部、尾部等处呈现不同程度的苍白。中药组与坎地沙坦组上述状态均略优于模型组。

2.2 四组体重及生化指标比较干预后，模型组、中药组及坎地沙坦组体重与血清白蛋白水平低于空白组，而24 h尿蛋白高于空白组，差异均有统计学意义（P<0.05）。中药组与坎地沙坦组体重与血清白蛋白均高于模型组，而24 h尿蛋白均低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。中药组与坎地沙坦组体重、24 h尿蛋白及血清白蛋白比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.3 四组足细胞肌动蛋白骨架相关指标mRNA相对表达量比较干预后，模型组、中药组及坎地沙坦组RANK、RANKL mRNA相对表达量均高于空白组，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相对表达量均低于空白组，差异均有统计学意义（P<0.05）。中药组及坎地沙坦组RANK、RANKL mRNA相对表达量均低于模型组，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相对表达量均高于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）。中药组及坎地沙坦组上述各指标比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.4 四组电镜下肾小球足细胞情况空白组电镜下可见正常足细胞排列，足突结构完整。模型组可见足突融合，足细胞结构破坏。中药组及坎地沙坦组足突融合程度较轻，可见少量完好足细胞。见图1。

3 讨论

作为肾小球固有细胞，足细胞附着于肾小球基底膜外侧，与毛细血管内皮共同构成肾小球血液滤过屏障，该屏障结构复杂，任何一处发生异常都可导致整体结构破坏而出现功能障碍[6]。因此，蛋白尿产生的根本即为足细胞损伤[7]。免疫因子破坏，抗原抗体复合物沉积、血流动力学改变都可以损伤足细胞结构，造成足突融合、足细胞凋亡等，从而产生尿蛋白，除此之外，足细胞特异蛋白分子下调和足细胞细胞骨架成分的变化，也可以引起上述病理改变，影响肾小球滤过屏障，产生蛋白尿[8]。α-actinin-4是足细胞的一种细胞骨架蛋白，该蛋白特异性的表达于肾小球足细胞，能够交联肌动蛋白微丝，在它的作用下，松散的肌动蛋白可被交联成具有收缩能力的纤维束，从而保持足细胞结构[9]。Synaptopodin通过膜相关鸟苷酸反转激酶1抗原与肌动蛋白微丝紧密相连，可维持足细胞足突部分的正常形态，是足细胞重要的骨架调节蛋白，其他肾脏疾病的研究及本文所属课题研究中发现，RANKL与RANK在这些疾病中高表达，并且与Synaptopodin高度重合，提示RANK特异性表达于足细胞，参与足细胞损伤[10]。

本研究结果显示，干预后模型组幼鼠一般状态差、眼睑可见水肿，电镜下可见足突融合破坏，模型组体重与血清白蛋白低于空白组，而24 h尿蛋白高于空白组（P<0.05）;中药组与坎地沙坦组体重与血清白蛋白均高于模型组，而24 h尿蛋白均低于模型组（P<0.05）。干预后，模型组、中药组及坎地沙坦组RANK、RANKL mRNA相对表达量均高于空白组，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相对表达量均低于空白组（P<0.05）。中药组及坎地沙坦组RANK、RANKL mRNA相对表达量均低于模型组，而α-actinin-4、Synaptopodin mRNA相对表达量均高于模型组（P<0.05）。提示坎地沙坦与当归芍药散能下调RANK、RANKL mRNA表达水平，延缓足细胞破坏，并能上调肾脏α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表达水平，使肾小球足细胞结构趋于稳固，从而对肾病综合征产生治疗作用。坎地沙坦在肾脏疾病的治疗中应用较为广泛，能够通过调节肾素-血管紧张素-醛固酮系统降低肾小球内压，从而降低尿蛋白，并对肾小球具有一定程度的保护作用，其疗效确切，副作用较小，在临床上应用较为广泛[11]。当归芍药散出自《金匮要略》，方中当归味甘辛性温，归心肝脾经，可滋养肝血并能消肿止痛[12-13];白芍味苦酸甘，归肝脾经，可养血调经、柔肝止痛[14];归、芍配伍共为君药，具养血柔肝之功[15];佐以川芎辛温，行血中之滞气，为血中之气药[16];茯苓味甘性平，可渗湿以利小便[17];白术味甘苦性温，可健脾燥湿祛体内之湿邪[18];全方合用，具有养血调肝，健脾利湿之功效，可治疗肾病综合征水肿脾虚水泛证型，其临床疗效较好[19-20]。

综上所述，当归芍药散对阿霉素肾病综合征幼鼠具有一定的治疗作用，这种作用可能是通过改善其肾脏RANK、RANKL、α-actinin-4、Synaptopodin mRNA表达来实现的。

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