高效液相色谱法测定鲜竹沥中抑菌剂苯甲酸的含量*

2020-11-09刘良玉刘绪平罗跃华张文婷

化学工程师 2020年10期

陈希，刘良玉，张静，刘绪平，罗跃华，张文婷

（1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，江西南昌330029；2.江西省医疗器械检测中心，江西南昌330029）

鲜竹沥收录在《本草经集注》中，为禾本科植物粉绿竹及同属植物的鲜杆经加热后获得的液体，主产于浙江、江西、福建等地，现收录在《卫生部药品标准》中药材第一册中，具有清热化痰之功效，主要用于治疗肺热咳嗽、多痰、小儿痰热惊风等症状[1-3]。中药水溶性液体制剂含有丰富的营养物质，容易滋生和繁殖微生物，一般需添加抑菌剂（也称防腐剂）以防范药品在生产、储藏和使用中由微生物污染导致的药品变质[4,5]。但加入过量的抑菌剂，又会增加副作用，长期饮用会引起人慢性苯中毒，主要表现为神经衰弱，如头痛、头晕等[6]。鲜竹沥一般以苯甲酸钠作为抑菌剂，其抑菌效果主要取决于其未解离的酸分子，所以一般调节药液pH 值为弱酸性[7]。苯甲酸钠作为鲜竹沥处方中重要组成部分，是否正确使用直接关系到鲜竹沥的质量，《卫生部药品标准》中药材第一册鲜竹沥标准缺少苯甲酸的测定。

目前，对苯甲酸的检测方法主要有紫外分光光度法、高效液相色谱（HPLC）法、气相色谱法等[8-10]。由于中药制剂中物质复杂，本研究选用前处理简便又能消除干扰的HPLC 法测定鲜竹沥中苯甲酸的含量。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

岛津LC-6AD 高效液相色谱仪（配二极管阵列检测器）；梅特勒-托利多MS205DU 电子天平；梅特勒-托利多FE20K pH 计。

鲜竹沥（市售）；阴性样品（未加苯甲酸钠的鲜竹沥，按鲜竹沥制法自制）；苯甲酸钠对照品（来源：中国食品药品检定研究院，批号：100433-201702，苯甲酸钠含量：99.7%）；KH2PO4、H3PO4：分析纯；甲醇（色谱纯）。实验用水为高纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Xpeonyx C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：0.1mol·L-1KH2PO4缓冲液（用H3PO4调pH值至4.0）-甲醇（65∶35），流量为1.0mL·min-1；柱温：40℃；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：227nm；样品进样体积：10μL。

1.3 溶液配制

对照品溶液精密称取苯甲酸钠对照品25.19mg，置于25mL 量瓶中，加水溶解并稀释至标线，摇匀，精密量取上述溶液5mL，置于50mL 量瓶中，加水稀释至标线，摇匀。

供试品溶液精密量取鲜竹沥样液5mL，置100mL 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

阴性样品溶液取阴性样品按供试品溶液制备方法制备。

2 结果与讨论

2.1 检测波长和流动相的选择

扫描苯甲酸钠光谱图，发现其在227nm 波长处有最大吸收。以0.01mol·L-1KH2PO4缓冲液作为盐相进行研究，发现该浓度苯甲酸峰前延且理论板数较差（拖尾因子0.653、理论塔板数9376），另采用0.1mol·L-1KH2PO4缓冲液时苯甲酸峰型更好（拖尾因子0.875、论塔板数17566）。还试验了以NH4Ac 缓冲液作为盐相的情况，由于NH4Ac 在碳氧键在227nm 波长下有吸收且NH4Ac 浓度较高，导致基线噪音很大。综合考虑选择0.1mol·L-1KH2PO4缓冲液作为盐相，并以227nm 作为检测波长，以降低基线噪音和检出限。

2.2 流动相pH 值的选择

调节0.1mol·L-1KH2PO4缓冲液pH 值至5.5，甲醇比例5 %时苯甲酸出峰时间约为13min，且12min后还有较多鲜竹沥的杂质峰，需要较长分析时间或采用梯度分析才能将杂质峰洗脱出来。利用苯甲酸为酸性物质，在酸性条件下保留时间会延长的特性，调节盐相pH 值至4.0，甲醇比例调整为35%，苯甲酸出峰时间仍约为12min，但鲜竹沥峰已洗脱完毕，消除了杂质对苯甲酸测定的干扰，节约了样品分析测定时间，提高了工作效率。故盐相pH 值选择调节到4.0。

2.3 专属性考察

供试品、对照品和阴性溶液按上述色谱条件实验，分别精密量取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10μL，注入色谱仪，色谱图见图1。

由图1 可知，供试品溶液主峰保留时间与苯甲酸钠对照品溶液主峰一致，阴性样品溶液12min 后已无峰出现，鲜竹沥峰已全部洗脱完毕，说明本方法专属性良好。

2.4 线性关系

按1.2 色谱条件，取对照品溶液分别进样1、2、5、10、20、30、40μL 并记录色谱图。以苯甲酸钠的峰面积为纵坐标（y），以苯甲酸钠的质量（x）为横坐标进行线性回归，计算得线性回归方程为y=4.0450×106x-1.0762×104，线性相关系数r2=1.0000。结果表明苯甲酸钠质量在0.1～4.0μg 之间与峰面积呈良好线性关系。

2.5 精密度和重复性试验

取对照品溶液，按“1.2”的色谱条件连续进样6针，苯甲酸钠峰面积（4067830、4074126、4073005、4073064、4071120、4073588）的RSD 为0.1%，说明方法精密度良好。取鲜竹沥样液（A 企业，批号：20190503）按“1.3”方法制备供试品6 份并按“1.2”的色谱条件分析，6 份样品中苯甲酸钠峰面积（4947406、4939417、4937455、4945242、4939141、4934722）的RSD 为0.1%，说明本方法重复性良好。

2.6 定量限和检出限

取对照品溶液倍比稀释，按“1.2”的色谱条件分析，以信噪比满足3∶1 和10∶1 计算检出限和定量限。计算得本方法苯甲酸钠的检出限和定量限分别为0.3ng 和1ng。

2.7 回收试验

精密称取苯甲酸钠对照品58.59mg 置25mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。取鲜竹沥样液（E 企业，批号：190703）2.5mL，置100mL 量瓶中，分别按低中高3 个浓度分别加入对照品储备液1.0、2.5 和4.0mL，再加水稀释至刻度，摇匀，每个浓度水平平行制备3 份。按“1.2”中色谱条件分析，记录色谱图并计算回收率。回收率为100.67%～102.38%，回收率RSD 为0.7%，平均回收率为101.6%。说明本方法准确度良好，详见表1。