基于网络药理学探讨土茯苓治疗发热的作用机制

徐 炎韩 晶任晓婷王 雷王钇杰刘 良姚 博王中天孙丽平

(1.长春中医药大学,长春 130117; 2.长春中医药大学附属医院,长春 130021)

发热是最常见的疾病指征之一,也在世界范围内医疗咨询的首要原因[1]。儿童因为其“纯阳之体”、“阳常有余,阴常不足”的生理病理特点,较之成人更容易罹患发热性疾病[2]。据统计,以发热为主诉就诊的患儿约占儿科门诊量的24.7%[3],主要表现为腋温超过37.3℃、肛温超过37.7℃、口温超过37.8℃,部分严重疾病治疗不及时可引起热性惊厥、神经系统损伤、残疾甚至死亡[4]。所以,在发热初期或者低热期有效控制体温,对保护儿童神经系统及治疗原发疾病都有巨大好处。

国医大师王烈教授经60 余年临床实践,发现土茯苓不仅可以治疗痛风[5]、皮肤病[6]、心血管病[7]等疾病[8],其在治疗各种原因引起的发热也有良好效果,每遇发热患儿,方中增加土茯苓清热,药到病除,效如桴鼓。

因发热有50%为感染性因素引起[9],本研究着重探讨感染性原因引起的发热,探索五个感染性疾病:细菌性肺炎、急性扁桃体炎、急性下尿路感染、外阴阴道炎、细菌性腹泻,可覆盖大多数儿童发热的病因。其中细菌性肺炎是全球严重的健康问题[10],是造成儿童死亡的首要因素[11];急性扁桃体炎是儿童及青少年的常见病和多发病,极易引起风湿热、肾炎、心肌炎等并发症,扁桃体过度肿大可造成呼吸困难,引起呼吸暂停而危及生命[12];急性下尿路感染是最常见的泌尿系统疾病,可引起菌血症、败血症、肾周脓肿等并发症,严重者可进展为肾衰竭[13];外阴阴道炎是小儿及青少年女性最主要的生殖道感染性疾病之一,不及时治疗可严重威胁生殖健康[14];细菌性腹泻是儿童消化系统最为常见的疾病,是导致婴幼儿营养不良的主要原因,持续性的腹泻可导致生长发育障碍[15]。本研究使用网络药理学方法,探讨土茯苓治疗此五种疾病的具体机制。以期为土茯苓的进一步的临床、实验研究及新的药研发提供思路和依据,文章最后探讨了土茯苓治疗发热理论基础及热点问题。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本研究中土茯苓的成份与靶点从TCMSP 数据库(http:/ /tcmspw.com/tcmsp.php)获取,疾病相关基因从 genecard 数据库(https:/ /www.genecards.org) 获取,靶点 Symbol 从 uniprot(https:/ /www.uniprot.org)数据库获取,分子对接蛋白构象从PDB(http:/ /www.rcsb.org)网站获取,蛋白互作网络(PPI 网络)string(https:/ /string-db.org/)网站制作,使用Cytoscape(版本号:3.6.1)软件进行网络图的构建,使用R(版本号:3.6.1)软件进行富集分析。

1.2 实验方法

1.2.1 土茯苓成份及靶点信息

以“土茯苓” 为关键词搜索 TCMSP 数据库(http:/ /tcmspw.com/tcmsp.php),并设定筛选条件为口服生物利用度(oralbioavailability,OB)≥30%、类药性(drug-like,DL)≥0.18,以确定可被人体吸收的活性成份[5]。并在Related Targets 栏目下根据上述活性成份获取相应靶点,并使用使用uniprot 进行矫正。

1.2.2 疾病相关基因

以“Bacterial pneumonia、Bacterial diarrhea、Acute tonsillitis、Acute bacterial lower urinary tract infection、Vulvovaginitis” 为 关 键 词 搜 索 genecard 数 据 库(https:/ /www.genecards.org)获取疾病相关基因。

1.2.3 网络模型的构建和分析

上述药物靶点和疾病基因取交集后使用Cytoscape3.6.1 软件构图,并使用 NetworkAnalyzer插件分析Degree 值和Betweenness Centrality。

1.2.4 基因本体(GO)富集和基因组百科全书(KEGG)通路富集

使用 R 软件中CludterProfiler 包进行GO 富集分析和 KEGG 富集,设置 pvaluecutoff = 0.05,qvaluecutoff=0.05[16]。

1.2.5 分子对接

分子对接方法基于之前的研究[17],IL-6(PDB ID:4CNI)、EGFR(PDB ID:5UG9)、CASP3(PDB ID:6CI0)、MYC(PDB ID:6C4U)、VEGFA(PDB ID:4WPB)蛋白均从PDB(http:/ /www.rcsb.org)网站获取。活性口袋大小均设置为x=15,y=15,z=15。Affinity 代表亲和力,亲和力越小代表相互作用越强。

2 结果

2.1 土茯苓活成成份筛选

使用TCMSP 共筛选出15 个活性成份,如表1所示。其中落新妇苷已经被证明可以抑制白介素1β(IL-1β)、IL-6 mRNA 的表达[18],增加 IL-10 的释放[19],减少细胞凋亡的作用[20]。β-谷甾醇可以增强机体氧自由基(OFR)的清除能力,提升血清NO含量,抑制肿瘤坏死因子(TNF-α) 的聚集与释放[21-22]。柚皮素可以抑制 NF-κB 途径的炎症细胞浸润、炎症介质的释放,抑制TNF-α 的分泌和肺嗜中性粒细胞浸润[23]。豆甾醇同样能抑制NF-κB 通路[24],减少由脂多糖(LPS)诱导的环氧化酶-2(COX-2)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA 的表达,同时通过减少 PGE2和 NO 的释放[25]。槲皮素可以抑制诱导型一氧化氮合酶(iN-OS)、环氧化酶 2(COX-2)和 C 反应蛋白(CRP)的水平[26]。薯蓣皂苷元可通过抑制酪氨酸激酶2(CK-2),激活JNK、NF-κB 和转录激活因子(AP-1),减少巨噬细胞产生的活性氧(ROS)、IL-1 和IL-6 等炎症介质发挥抗炎作用[27]。

2.2 土茯苓活性成份的核心成份

使用TCMSP 数据库筛选土茯苓活性成份靶点并使用uniprot 逐一输入转换为基因Symbol,其中落新妇苷未查询到靶点,新落新妇苷、异黄杞苷未查询到基因Symbol,最终得到12 个活性成份的145 条基因Symbol。使用genecard 获取疾病相关基因,其中细菌性肺炎2484 条、急性扁桃体炎9137 条、急性下尿路感染3977 条、外阴阴道炎106 条、细菌性腹泻2556 条。分别对药物靶点与疾病靶点取交集,摘出靶点对应的药物活性成份,发现土茯苓活性成份中有5 个分别对五种疾病均起作用,分别为柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蓣皂苷元、豆甾醇,如图1 所示,将此5 个成份视为土茯苓治疗发热的核心成份。

图1 土茯苓活性成份与五种疾病的韦恩图Figure 1 Venn diagram of the active ingredients of glabrous greenbrier rhizome and five diseases

表1 土茯苓活性成份Table 1 Active ingredients of glabrous greenbrier rhizome

2.3 土茯苓-靶点-基因-疾病网络

土茯苓-靶点-基因-疾病网络如图2 所示,共有111 个节点,460 条边。基于网络的 Degree 值和Betweenness Centrality 值发现成份中同样为柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蓣皂苷元、豆甾醇的值最高,为核心成份。靶点中 PTGS1、PGR、RELA、NR3C2、AKR1B1 的值 Degree 值和 Betweenness Centrality 值最高,但靶点蛋白并不是单独存在的,蛋白与蛋白之前在体内存在着互相作用,并不能单以靶点在网络中的连接个数判断靶点蛋白的重要性,为更准确探索网络中靶点之间的相互作用,进行了进一步研究。

2.4 土茯苓-疾病 PPI 网络

蛋白质作为细胞活性和功能的执行者,并不是独立存在的,蛋白质与蛋白质之间的相互作用在生命过程的各阶段及维持内环境的稳态中发挥着重要的作用。为了解析土茯苓-疾病靶蛋白的互相作用方式,提取土茯苓靶点与五种疾病基因的交集信息,构建了土茯苓-疾病靶蛋白的PPI 网络,如图3所示。根据 Degree 值和 Betweenness Centrality 值发现 IL-6、EGFR、CASP3、MYC、VEGFA 在土茯苓-疾病PPI 网络中起到了重要作用。其中,IL-6 是具有多种生物学功能的细胞因子,参与炎症反应的多种过程,CASP3 是细胞凋亡的主要执行者,下调可显著减少炎症损伤程度[28]。EGFR 能抑制脂多糖诱导的急性肺损伤,有助于降低炎症反应[29-30]。MYC可调节细胞增殖与细胞凋亡,同样与炎症的发生密切相关[31]。VEGFA 可调低炎症因子 IFN-γ,IL4 和IL17 A 的表达,从而减少炎症的发生[32]。

2.5 GO 和 KEGG 富集分析

为进一步探索土茯苓-疾病靶点在体内生物过程的作用,将靶基因进行GO-BP 和KEGG 富集,如图4 所示。GO-BP 中 response to xenobiotic stimulus是指由于外来生物的复合刺激导致细胞或有机体的状态或活动(如运动、分泌、酶的产生、基因的表达等)发生变化的过程。由于感染多由于细菌、病毒等外源病原体侵袭所致,所以土茯苓所调控的基因在机体对外界反应过程可能存在着重要的作用。KEGG 中 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance 通路提示土茯苓可调节是EGFR 抑制剂的耐药[33],在前面已经提到调低EGFR 可减少炎症的发生,而此处KEGG 富集结果进一步证明了土茯苓可能还有使已耐药的EGFR 抑制剂敏化的作用。

图2 土茯苓-靶点-基因-疾病网络Figure 2 Glabrous greenbrier rhizome-target-gene-disease network

2.6 土茯苓核心成份-靶点分子对接

以上研究已经证明了土茯苓治疗感染性疾病的核心成份为柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蓣皂苷元和豆甾醇,其主要作用的功能蛋白为IL-6、EGFR、CASP3、MYC 和VEGFA。但结果均基于网络药理学的模拟,有待验证。为进一步明确已得结论,采用分子对接方法分别使用柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蓣皂苷元和豆甾醇与 IL-6、EGFR、CASP3、MYC和VEGFA 进行对接验证,如图5 所示。除薯蓣皂苷元与CASP3 对接的亲和力较弱之外,其他所有分子均可与靶蛋白以强亲和力对接。

图3 土茯苓-疾病PPI 网络Figure 3 Glabrous greenbrier rhizome-disease PPI network

图4 GO-BP 和 KEGG 分析Figure 4 GO-BP and KEGG analysis

图5 土茯苓核心成份与靶蛋白分子对接Figure 5 Interaction of glabrous greenbrier rhizome with core components and target protein molecules

3 讨论

3.1 土茯苓治疗发热的理论基础

土茯苓出自《滇南本草》,味甘、淡,性平。有解毒,健脾除湿,通利关节之功效。王烈教授认为土茯苓退热之功有三,一为健脾退热:土茯苓具有健脾之功,脾为后天之本,脾健则水谷精微充足,宗气旺盛,正气充沛则驱邪有力,再则脾为肺之母,脾健则肺气充沛,呼吸有力,气有所运,卫有所固,外邪难以侵入。二为除湿退热:湿本黏滞重浊易化热,土茯苓本具“祛湿热,利筋骨”之功,王烈教授根据数十年临床经验,扩大了土茯苓的治疗范围,认为土茯苓全身之湿热都可除之,不仅关节而。三为益气退热:土茯苓又叫白余粮,本为充饥之食物,可为人体提供能量所需,使脾胃有所运化,为气血津夜的化生的物质基础,能补充人体精微物质,提升正气以祛邪退热。总之,王烈教授认为儿童发热性疾病,无论何种原因引起,都可用土茯苓退热,且效如桴鼓。

3.2 土茯苓治疗发热的物质基础和主要靶点

本研究通过TCMSP 数据库以OB＞30%和DL＞0.18 为指标筛选土茯苓的分子成份,初步筛选出15个主要成份。15 个成份对应的靶蛋白输入uniprot矫正后得到了12 个成份的145 个基因Symbol。进一步使用genecard 获取疾病基因与土茯苓成份进行交集后构建土茯苓-靶点-基因-疾病网络,发现柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蓣皂苷元、豆甾醇的Degree值和Betweenness Centrality 值最高,为土茯苓的核心成份。PPI 网络发现 IL-6、EGFR、CASP3、MYC、VEGFA 为土茯苓治疗发热的核心靶点,使用靶点富集GO 分析的生物过程发现response to xenobiotic stimulus 为主要的富集通路,KEGG 富集发现土茯苓可能还有使已耐药的EGFR 抑制剂敏化的作用。最后,为了对已得出的结论进一步验证,使用柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蓣皂苷元和豆甾醇分别与IL-6、EGFR、CASP3、MYC 和 VEGFA 进行分子对接,成功验证了成份与靶点的亲和力。总之,我们的研究认为土茯苓治疗发热的主要物质基础为柚皮素、β-谷甾醇、槲皮素、薯蓣皂苷元和豆甾醇,主要靶点为IL-6、EGFR、CASP3、MYC 和 VEGFA。

3.3 发热有益还是有害

由于复杂的炎症反应导致了热源性细胞因子如 IL-1、IL-6、TNF-α 的大量合成、释放和堆积[34],进而导致热性惊厥、神经系统损伤、残疾甚至死亡的发生,发热一直被认为是威胁健康的症状或疾病。然而,现代研究同样证明了热源性细胞因子堆积的同时,先天免疫反应也会被迅速激活,进而消灭病原体,发热毫无疑问也是人体免疫机制的重要组成部分[35]。关于发热对人体有益还是有害的争论似乎从未停止[36]。本研究基于中医理论认为“火者,阳气也”、“少火之气壮…少火生气”、“人非此火,不能生养命根”,认为在五行生克制化范围内的火气,偏于补充人体阳气,能温阳周身,助人抗邪,实属大善。但《内经知要》也云:“但阳和之火则生物,亢烈之火反害物,故火太过则气反衰,火和平则气乃壮”,认为平和之火可增强人体正气,增加对病邪的抵抗力。亢烈之火不仅对人体无益,反而耗气伤津,加重病情,故临床仍需分辨平和之火和亢烈火。具体在发热病症中,本研究认为患病过程中维持一定体温对抗邪有益无害,只要控制恰当,不产生热性惊厥、神经损伤等并发症,发热的效果或可优于使用针药。