槲皮素对人前列腺癌PC- 3细胞自噬及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响

宋 静，白吉祥，王书惠，刘伦翠，赵志轩

牡丹江医学院附属红旗医院 1泌尿外科 2中西医结合·老年病科，黑龙江牡丹江 157011

前列腺癌是泌尿生殖系统好发的肿瘤之一，近年来在我国成为发病率、病死率升高最快的肿瘤，严重威胁男性健康[1- 2]。因此，寻找疗效确切的抗前列腺癌药物，可能成为提高前列腺癌治愈率的重要研究方向。近年来，天然药物及其单体成分在抗肿瘤方面的研究取得很大进展。具有多靶点、低毒性、良好疗效等的抗肿瘤中药受到越来越多的关注。槲皮素是一种广泛存在于蔬菜、水果及谷物等植物中的植源性黄酮类化合物，也存在于多种中草药中，如款冬花、三七、高良姜、银杏等。研究发现，槲皮素具有抗炎、抗过敏、抗病毒、扩张冠状动脉，抗血小板聚集和抗氧化等药理作用[3]。随着研究深入，发现槲皮素具有较强的肿瘤预防及治疗作用，如宫颈癌、胰腺癌、直肠癌、胃癌、口腔癌、乳腺癌和肺癌等[4- 10]。也有研究表明，槲皮素可抑制人前列腺癌PC- 3细胞增殖，并诱导其凋亡[11- 13]。但是，目前关于槲皮素诱导PC- 3细胞自噬的研究却鲜见报道。本研究观察了槲皮素对PC- 3细胞活力、凋亡、自噬及磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路的影响，以期为槲皮素抗前列腺癌作用的深入研究和临床应用提供参考。

材料和方法

材料人前列腺癌细胞株PC- 3购自中国科学院细胞库，复苏PC- 3 细胞，用10% FBS和1%青链双抗的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，取对数生长期细胞用于后续实验。槲皮素(纯度>98.0%)购自美国Sigma公司，槲皮素溶解于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO，终浓度≤0.01%)配成200 μmol/L母液，-20℃保存，临用时以RPMI1640培养基稀释到所需浓度。FBS、RPMI1640培养基、GFP-LC3和双抗生素均购自江苏碧云天生物技术研究所，DMSO购自上海士锋生物科技有限公司。CCK- 8检测试剂盒和TUNLE凋亡检测试剂盒均购自美国Abbkine公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。3-甲基腺嘌呤(3-MA，自噬抑制剂)、吖啶橙购自美国Sigma 公司，LC3 抗体、Beclin- 1 抗体、PI3K抗体、磷酸化-PI3K(p-PI3K)抗体、Akt抗体、磷酸化-Akt(p-Akt)抗体、mTOR 抗体、磷酸化-mTOR(p-mTOR)抗体及HRP标记二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司。

CCK- 8细胞活力实验检测PC- 3细胞活力将处于对数生长期的PC- 3细胞以1×104个细胞/孔密度接种于96孔培养板中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。待细胞贴壁后，加入不同浓度槲皮素(0、50、100、150、200 μmol/L)于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24、48、72 h后，在相应时间点分别加入10 μl/孔CCK- 8混匀，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱继续孵育90 min。酶标仪测定在450nm处的OD值。以空白培养液作为空白对照组，计算细胞活力：细胞活力(%)=(OD实验组-OD空白对照组)/(OD0 μmol/L槲皮素-OD空白对照组)×100%。每组设6个复孔，取平均值。

TUNEL法检测PC- 3细胞凋亡参照CCK- 8细胞活力实验结果，将处于对数生长期的PC- 3细胞以5×105个细胞/孔密度接种于6孔培养板中，37℃、5%CO2饱和湿度下过夜培养。加入不同浓度槲皮素[0(对照组)、50、100、150、200 μmol/L]，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。严格按照TUNEL凋亡检测试剂盒说明书检测PC- 3细胞凋亡指数。凋亡细胞核发出绿色荧光，未凋亡细胞核发出蓝色荧光。荧光显微镜下观察PC- 3细胞核荧光变化并计数，计算凋亡指数：凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%。每个剂量组随机选取6个高倍视野(×200)，取平均值。

吖啶橙染色观察PC- 3细胞自噬小泡将处于对数生长期的PC- 3细胞以4×106个细胞/ml密度爬片，综合CCK- 8细胞活力实验和TUNEL染色结果，随机分为：(1)对照组：给予0 μmol/L槲皮素；(2)槲皮素组：给予100 μmol/L槲皮素；(3)3-MA组：给予5 mmol/L 3-MA；(4)槲皮素+3-MA组：给予100 μmol/L槲皮素+5 mmol/L 3-MA。37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。用PBS漂洗3次后，滴加新配制的1 mg/L吖啶橙染色液，37℃避光孵育15 min，吸去吖啶橙染色液，用PBS漂洗3次。50%甘油封片，置于倒置荧光显微镜下观察酸性的自噬小泡，每个剂量组随机选取6个视野。

GFP-LC3质粒转染分析观察PC- 3细胞自噬小体将处于对数生长期的PC- 3细胞以4×106个细胞/ml密度爬片，待细胞生长融合度达到50%后，根据Lipofectamine TM2000说明书将GFP-LC3质粒转染PC- 3细胞，6～8 h后更换新的培养液，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h。将转染后的PC- 3细胞分组及给药同“吖啶橙染色实验”。37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h，置于倒置荧光显微镜下观察酸性的自噬小体，每个剂量组随机选取6个视野。

Western blot分析检测自噬相关蛋白和PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白的表达将处于对数生长期的PC- 3细胞以5×105个细胞/孔密度接种于6孔培养板中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养；待细胞贴壁后，分别加入0(对照组)、100、150 μmol/L槲皮素，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养24 h；弃去培养液，PBS漂洗3 次；用RIPA细胞裂解液在冰上进行裂解，提取总蛋白；4℃16 000×g离心5 min，取上清。BCA法测定总蛋白浓度，按4∶1加入Loading Buffer，100℃煮样5 min；取30 μg蛋白上样进行10%SDS-PAGE凝胶电泳；转印到PVDF上；5%脱脂牛奶或牛血清白蛋白室温封闭1 h；一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加入相应二抗室温慢摇孵育1 h，TBST 洗膜3次，每次10 min。ECL化学发光试剂显色，凝胶成像系统对各组条带进行计值及统计分析。每组设6个复孔，取平均值。

统计学处理采用SPSS 17.0统计软件，符合正态分布的数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；采用bonforroni多重校正方法进行多组间差异的两两比较；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

槲皮素抑制PC- 3细胞活力CCK- 8细胞活力实验检测结果显示，随着处理浓度增大和处理时间延长，槲皮素对PC- 3细胞活力的抑制作用明显增强，且呈一定的浓度-时间依赖关系(图1)。处理24、48、72 h后，槲皮素对PC- 3细胞IC50分别为158.6、107.8、79.1 μmol/L。

图1 槲皮素抑制PC- 3细胞活力

槲皮素促进PC- 3细胞凋亡TUNEL染色结果显示，槲皮素50、100、150、200 μmol/L组的凋亡指数分别为(7.91±0.84)%、(20.69±2.34)%、(48.74±5.55)%、(62.91±6.69)%，其中，100(t=5.437，P=0.016)、150(t=7.390，P=0.002)、200 μmol/L组(t=7.944，P=0.001)的凋亡指数明显高于对照组的(7.26±0.78)%，50 μmol/L组与对照组差异无统计学意义(t=0.559，P=0.605)(图2)。

A.对照组；B.槲皮素50 μmol/L；C.槲皮素100 μmol/L；D.槲皮素150 μmol/L；E.槲皮素200 μmol/L

槲皮素增加PC- 3细胞自噬小泡数量吖啶橙染色结果显示，槲皮素组PC- 3细胞中的红色荧光明显较强；槲皮素+3-MA组PC- 3细胞中也可见红色荧光，但是较槲皮素组弱；对照组和3-MA组PC- 3细胞中基本未见红色荧光，几乎无自噬小泡(图3)。

A.对照组；B.槲皮素组；C.3-MA组；D.槲皮素+3-MA组

槲皮素增加PC- 3细胞自噬小体形成GFP-LC3质粒转染分析结果显示，槲皮素组转染GFP-LC3的PC- 3细胞中可见绿色点状自噬小体；槲皮素+3-MA组转染GFP-LC3的PC- 3细胞中也可见出现绿色点状的自噬小体，但是较槲皮素组少；对照组和3-MA组PC- 3细胞中极少有自噬小体形成(图4)。

A.对照组；B.槲皮素组；C.3-MA组；D.槲皮素+3-MA组

槲皮素升高PC- 3细胞自噬相关蛋白表达Western blot检测结果显示，槲皮素组PC- 3细胞的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=6.007，P=0.004)和Beclin- 1表达(t=4.778，P=0.009)均显著高于对照组，3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=0.900，P=0.419)和Beclin- 1表达(t=2.485，P=0.068)与对照组相比差异无统计学意义，槲皮素+3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=0.139，P=0.896)和Beclin- 1表达(t=2.710，P=0.054)与对照组相比差异也无统计学意义；3-MA组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=5.564，P=0.005)和Beclin- 1表达(t=6.608，P=0.003)显著低于槲皮素组，槲皮素+3-MA组PC- 3细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(t=6.022，P=0.004)和Beclin- 1表达(t=6.737，P=0.003)也显著低于槲皮素组(图6)。

槲皮素通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路诱导PC- 3细胞发生自噬Western blot检测结果显示，槲皮素100 μmol/L组PC- 3细胞的PI3K(t=0.103，P=0.925)、Akt(t=0.241，P=0.821)和mTOR表达(t=0.206，P=0.847)与对照组相比差异无统计学意义，p-PI3K(t=4.613，P=0.010)、p-Akt(t=4.506，P=0.011)和p-mTOR表达(t=3.578，P=0.0.023)显著低于对照组；槲皮素150 μmol/L组PC- 3细胞的PI3K(t=0.271，P=0.795)、Akt(t=0.512，P=0.636)和mTOR表达(t=0.277，P=0.795)与对照组相比差异无统计学意义，p-PI3K(t=5.798，P=0.004)、p-Akt(t=6.071，P=0.004)和p-mTOR表达(t=4.553，P=0.011)显著低于对照组(图6)。

与对照组比较，aP<0.01；与槲皮素组比较，bP<0.01

PI3K：磷脂酰肌醇3激酶；p-PI3K：磷酸化磷脂酰肌醇3激酶；Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化蛋白激酶B；mTOR：哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；p-mTOR：磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01

讨 论

本研究结果发现，槲皮素具有呈浓度-时间依赖性抑制PC- 3细胞活力的作用，亦具有明显诱导PC- 3细胞凋亡的作用，以上结果均与以往研究结果相一致[11-13]。用槲皮素处理PC- 3细胞24 h后，当槲皮素浓度(50、100、150 μmol/L)较低时，对PC- 3细胞未见明显细胞毒性作用，而浓度(200 μmol/L)较高时，PC- 3细胞活力显著受到抑制。为了探讨槲皮素自身没有细胞毒性的处理浓度对PC- 3细胞自噬的影响，综合TUNEL染色实验结果，本研究后续实验采用100、150 μmol/L为槲皮素的处理浓度。

自噬是一种将细胞中需要降解的细胞器及未折叠的蛋白等在溶酶体内分解代谢的生物学过程[14]。大多数学者认为自噬是一种重要的细胞死亡机制。促进肿瘤细胞自噬活性甚至诱导自噬性死亡可以起到抗肿瘤作用[15]。LC3是自噬发生过程中非常重要的一个标志性蛋白。前体LC3蛋白合成之后经过加工修饰形成LC3-Ⅰ型蛋白，自噬活化时LC3-Ⅰ酯化形成LC3-Ⅱ 型蛋白，并定位于自噬泡，因此其水平在一定程度上反映了自噬体的数量和自噬程度，也常作为自噬发生的一个指标[16- 17]。而Beclin- 1是哺乳动物参与自噬的特异性蛋白，是自噬的直接执行者[18]。本研究结果发现，槲皮素具有明显诱导PC- 3细胞自噬小泡数量和自噬小体形成的作用及明显增加PC- 3细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值和Beclin- 1的表达量，加入3-MA后自噬小泡数量和自噬小体形成则明显减少及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin- 1的表达水平明显下降。以上结果提示，槲皮素可能具有诱导PC- 3细胞自噬作用。

为阐明槲皮素诱导PC- 3细胞发生自噬的可能机制，本研究对PI3K/Akt/mTOR 信号通路中所涉及的一些关键蛋白进行了检测。结果发现，PI3K/Akt/mTOR信号通路在自噬中发挥关键的调节作用，针对该信号通路选择抑制性药物治疗肿瘤已经取得较为满意的效果[19]。PI3K属于脂类激酶家族，是一种广泛存在于胞质内的磷脂酰肌醇激酶，能被许多细胞因子受体活化，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类。PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K主要指Ⅰ类PI3K，Ⅰ类PI3K激活丝氨酸/苏氨酸激酶Akt，之后通过一系列调控使mTOR磷酸化，从而抑制自噬[20]。本研究发现，槲皮素具有明显抑制PC- 3细胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达的作用。以上结果提示，槲皮素可能具有抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的作用。

综上，本研究结果显示，槲皮素可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导PC- 3细胞发生自噬。至于是否与其他机制有关，如Janus激酶/信号转导子与转录激活子信号通路，今后将会做进一步探讨。