血CTCs、cfDNA检测在乳腺癌中的应用

常立伟 杨东炜 刘东辰

目前乳腺癌已成为女性最为常见的恶性肿瘤，其发病率在全球范围内均持续增长，具有较高的死亡率［1］。我国乳腺癌发病率也长期居高不下，且发病年龄呈年轻化趋势，严重威胁女性健康状况［2-3］。早期乳腺癌无明显症状，发现困难，延误治疗现象严重。因此，针对乳腺癌病变的早期发现是目前医学领域关注的重点。现阶段常用的诊断方法主要为一些影像学检测手段，如乳腺B 超、乳腺钼靶、磁共振等，但仍需要简便操作、无创、价廉的血清肿瘤标志物提高诊断准确性［4］。根据美国临床生化科学院（National Academy of Clinical Biochemistry，NACB）检验医学时间指南推荐，已将糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、糖类抗原153（carbohydrate antigen 153，CA153）及癌胚抗原（carcino-embryonic antigen，CEA）等血清肿瘤标志物用于乳腺癌的诊断［5］。随着分子生物技术的迅猛发展，循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）、循环游离DNA（circulating free DNA，cfDNA）检测在癌症诊疗过程中的作用成为研究热点［6］。本研究旨在探究血CTCs、cfDNA 联合检测在乳腺癌中的应用价值，并分析血CTCs、cfDNA 水平与患者临床病理特征及预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年4月至2016年4月经手术治疗的乳腺疾病患者163 例，其中85 例术后病理确诊为乳腺癌（乳腺癌组），另78 例为乳腺良性疾病患者（良性疾病组），同时募集同期入院体检健康女性50 例（对照组）。乳腺癌组患者平均年龄（45.46±11.62）岁；良性疾病组患者平均年龄（43.29±12.73）岁；对照组平均年龄（46.35±10.58）岁。3 组年龄资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。纳入标准：乳腺癌患者经术后病理检测确诊，且为首次、单侧发病；具有手术指征；签署知情同意书。排除标准：患者术前接受放化疗、内分泌治疗等；合并其他恶性肿瘤；严重心、肝、肾等功能不全；合并出血性疾病；存在严重系统性疾病或感染；处于妊娠、哺乳期女性；精神异常，存在沟通障碍。本研究经本院伦理委员会批准，各组受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 病例资料及样本采集

收集受试者一般人口学资料和疾病相关资料，并采集受试者空腹下肘部静脉血5 mL，室温静置后待测。

1.2.2 血CTCs 检测

采用免疫磁珠阴性富集法富集血液样本中的细胞，进行荧光原位杂交实验，再通过免疫荧光染色定位CTCs 细胞，最后荧光显微镜下计数CTCs和判读结果。判读标准：以2 个CTCs/3.2 mL 血液为临界值，任一探针信号点＞2 个，无血源性白细胞表面抗原着色时，可计为1 个阳性细胞，阳性细胞＞1 个时即为阳性［7］。

1.2.3 血cfDNA、肿瘤标志物检测

分离样本血浆，参照QIAGEN 血液基因组DNA 纯化试剂盒（批号：51106）说明书操作，提取血浆DNA，采用荧光定量PCR 检测血浆DNA 含量。其中GADPH 上游引物：5′GGAAGGTGAA GGTCGGAGTC3′，下游引物：5′GAAGATGGTGA TGGGATTC3′，探针序列：5′FAM-CAAGCTTCC CGTTCTCAGCC-TAMRA3′。以≥1×103基因拷贝数为阳性标准［8］。

应用全自动微粒子化学发光酶免疫分析仪，检测样本血清中CA125、CA153 及CEA 的浓度，其中各指标阳性标准为：CA125＞35 U/mL，CA153＞31.5 U/mL，CEA＞5 U/mL，联合检测时任一指标超标即为阳性［9］。

1.2.4 术后随访

术后通过门诊复查形式随访1年，随访时间截止2019年4月30日，记录患者疾病进展情况，将其中出现疾病进展的患者作为疾病进展组，剩余患者作为无疾病进展组，比较两组血CTCs、cfDNA水平。

1.3 统计学方法

采用软件SPSS 17.0 分析处理数据，计量资料以（±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线描述血CTCs、cfDNA 对于乳腺癌诊断的可行性，以曲线下面积（area under the curve，AUC）大小表示其诊断价值，组间比较采用Z检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清CTCs、cfDNA、CA125、CA153 及CEA 水平的比较

各组血清CTCs、cfDNA、CA125、CA153 及CEA 水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），其中乳腺癌组上述指标水平明显高于良性疾病组和对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），但良性疾病组和对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 各组血CTCs、cfDNA、CA125、CA153 及CEA 水平的比较（±s）Table 1 Comparison on levels of serum CTCs，cfDNA，CA125，CA153 and CEA among all groups（±s）

表1 各组血CTCs、cfDNA、CA125、CA153 及CEA 水平的比较（±s）Table 1 Comparison on levels of serum CTCs，cfDNA，CA125，CA153 and CEA among all groups（±s）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与良性疾病组比较，bP＜0.05。

指标CTCs（个）cfDNA（×103基因拷贝数）CA125 CA153 CEA乳腺癌组（n=85）1.34±0.29ab 29.65±8.57ab 22.37±7.24ab 35.84±11.62ab 6.69±2.13ab良性疾病组（n=78）0.03±0.01 0.05±0.01 16.21±5.20 9.13±2.65 1.85±0.54对照组（n=50）0.00±0.00 0.03±0.01 15.43±4.67 8.87±2.41 1.76±0.42 F 值1325.262 762.096 29.931 316.891 309.314 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 血CTCs、cfDNA 诊断乳腺癌的ROC 分析

ROC 分析血CTCs、cfDNA 单独或联合及三项联合检测诊断乳腺癌的AUC 高于传统肿瘤标志物诊断，差异具有统计学意义（P＜0.05），但cfDNA、CTCs+cfDNA 及三项联合检测间两两AUC 比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图1。

2.3 血CTCs、cfDNA 水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系

肿瘤大小≥2 cm 乳腺癌患者血CTCs 阳性率高于肿瘤大小＜2 cm 者，差异具有统计学意义（P＜0.05），CTCs 阳性率在不同年龄、病理类型、绝经情况、TNM 分期、分化程度、淋巴结转移患者间的比较差异无统计学意义（P＞0.05）；有淋巴结转移者cfDNA 阳性率高于无转移者，差异具有统计学意义（P＜0.05），cfDNA 阳性率在不同年龄、病理类型、绝经情况、肿瘤大小、TNM 分期、分化程度患者间的比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 血CTCs、cfDNA水平与乳腺癌患者预后的关系截止2019年4月30日，85 例乳腺癌患者术后

有22 例出现疾病进展，其中疾病进展者CTCs、cfDNA 阳性率分别为19（86.36%）和22（100.00%），均高于无疾病进展组34（53.97%）和49（77.78），差异具有统计学意义（χ2=7.290，P＜0.05）。

表3 血CTCs、cfDNA 水平与乳腺癌患者临床病理特征的关系［n（%）］Table 3 Relationship between serum CTCs，cfDNA levels and clinicopathological features of breast cancer patients［n（%）］

3 讨论

CTCs 是外周血中的各类肿瘤细胞的总称，这些细胞大多是原发肿瘤部位、复发或转移病灶脱落从而进入血液循环，具有与肿瘤特异性相关的抗原蛋白质和遗传变异表达［10］。cfDNA 是外周血游离的DNA 总称，常以蛋白复合体形式存在，包括肿瘤来源的DNA 和正常细胞来源的DNA。由于癌症患者血浆中核酸酶活性降低，cfDNA 的清除率降低，导致癌症患者cfDNA 浓度高于健康者［11］。故检测cfDNA 水平可实时监测癌组织情况。张潇分等［12］研究指出，CTCs 和cfDNA 可能是乳腺癌辅助诊断的潜在生物学标志。本研究结果提示CTCs、cfDNA 在乳腺癌的诊断中均具有较高价值，与上述文献结果基本相符。但考虑CTCs 和cfDNA 的检测方法和阳性标准不同，后续还需要加大样本量进行验证。CA125、CA153 及CEA 是常用的乳腺癌诊断血清标志物，上述指标对于乳腺癌均有较高的敏感性，但特异性较差［13］。本研究将联合检测中任一指标阳性指定为阳性结果进一步说明血CTCs、cfDNA 联合检测对于乳腺癌的早期诊断有较高的应用价值。在本研究中，比较3种不同检查方法单独或联合及部分联合的诊断价值，在国内外相关报道较少。

乳腺癌的临床治疗主要依据患者临床病理特征，因此，分析乳腺癌的临床病理特征与CTCs、cfDNA 的关系也是十分必要的。既往研究显示，CTCs 阳性与乳腺癌的临床分期、肿瘤大小、淋巴结状态及相关抗体表达有关［13］。而血cfDNA 检测作为一种液体活检，可动态评估乳腺癌患者临床疗效及预后［14］。本研究结果提示肿瘤直径越大，肿瘤细胞脱落进入血液循环的可能性更大；有淋巴结转移者cfDNA 阳性率高，可能是肿瘤细胞活跃增殖时释放更多DNA 进入血循环。但本研究中其他临床病理特征与CTCs、cfDNA 水平无明显相关性，后续将纳入更多研究对象深入分析其相关性。另外，术后随访结果显示，疾病进展患者CTCs、cfDNA 阳性率要高于无疾病进展组，与文献报道血CTCs、cfDNA可评估乳腺癌患者预后的结果相符［15-16］。

综上所述，血CTCs、cfDNA 检测对于乳腺癌有较高的诊断价值，且与患者临床病理特征及预后密切相关，可为乳腺癌患者的早期诊断和个体化治疗提供可靠依据。但目前血CTCs、cfDNA 诊断乳腺癌患者的截断值尚未有确切定义，还需要不断优化检测技术和数据分析方法，提高其临床利用率。