早孕期流产胚胎组织MLPA检测结果及与年龄和孕周的关系分析

陈杏园 罗世强 王秋华 袁德健 许泽辉 王敬仁 覃柳群 唐宁★

自然流产是指妊娠在28 周前自行终止，胎儿体重＜1 000 g 者，是健康育龄期妇女常见的妊娠并发症，约占临床妊娠的10%～15%［1］。造成胚胎停育的原因有很多，遗传因素在早孕期自然流产病因中占很大比例，有报道早期自然流产绒毛染色体异常率可达75%［2］，包括非整倍体、多倍体、部分缺失或部分重复等［3］。随之而来的生殖风险取决于重排类型及其亲本来源［4］。目前用于检测染色体畸变的方法多种多样，与常规细胞遗传学分析相比，多重连接依赖式探针扩增技术（multiple ligation-dependent probe amplification，MLPA）技术成本相对较低、劳动力密集度较低、并且等待时间较短、准确度较高，因此，MLPA 可以作为早期自然流产遗传学检测的首选方法［5］。本研究用MLPA 技术检测自然流产胚胎染色体异常，分析早期自然流产胚胎染色体异常情况并进一步分析其相关的影响因素，为进一步遗传咨询提供依据。

1 资料与方法

1.1 对象

收集2016年3月到2017年12月在柳州市妇幼保健院就诊的稽留流产孕妇患者774 例，患者具有停经史、血尿检查HCG 阳性；超声检查见空孕囊或宫腔内见胚芽或胚胎样组织，经检测无胎心；自愿接受流产绒毛组织染色体非整倍体检测。孕妇年龄19～44 岁，平均年龄31.7±5.9 岁，孕周为5周0 天～15 周3 天。

1.2 方法

1.2.1 流产绒毛组织基因组DNA 提取

镜下挑选5～10 mg 绒毛组织剪碎，常规酚-氯仿法提取基因组DNA。采用ASP-2680 核酸分析仪检测DNA 浓度纯度，A260/A280 在1.6～1.9 之间，浓度为）20～30 ng/μL。

1.2.2 MLPA 检测

采用P036 和P070 探针试剂盒（荷兰，MRCHonand 公司），23 对染色体中除13、14、15 染色体长臂2 个探针，Y 染色体长臂1 个探针外，其它染色体长、短臂末端各有2 个检测探针。提取DNA后经过变性、杂交、连接及PCR 反应后，取PCR产物进行毛细管电泳检测，并对检测数据运用Coffalyser 专用软件（荷兰MRC 公司）分析。

1.2.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行数据处理分析，检出率用百分率（%）表示，组间资料采用χ2检验进行分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MLPA 检测结果

收集774 例样本，检测成功98.97%（766/774），8 例因标本腐败提取的DNA 浓度和纯度无法满足实验要求。MLPA 检测发现染色体异常52.09%（399/774）。其中，染色体非整倍体畸变占50.26%，以47，XN，+16 比例最高，其次为47，XN，+22 和45，XO，同时检测出染色体单体，染色体双三体，嵌合体，和其它复杂染色体非整倍体畸变等，在复合型染色体畸变中也是涉及16、22 和X染色体的较多见；染色体部分缺失或重复占1.31%。见表1。

2.2 不同年龄段组流产胚胎染色体情况

孕妇在小于20 岁和大于35 岁年龄段其流产胚胎中染色体异常检出率明显较高（P＜0.05），在≥35 岁流产孕妇的胚胎中，染色体异常检出率高达66.53%。多条染色体非整倍体畸变，及大部分小染色体非整倍体畸变的流产胚胎多见于年龄≥35岁高龄孕妇，而涉及性染色体异常流产胚胎则多见于年龄＜35 岁孕妇。见表2。

2.3 不同孕周组流产胚胎染色体情况

不同孕周各组流产胚胎染色体异常情况见表3，孕周＜12 周流产人群中染色体异常检出率明显高于≥12 周的染色体异常检出率（P＜0.05），＜12 周流产人群的发生率高于≥12 周流产人群（P＜0.05）。见表3。

表1 流产胚胎MLPA 检测结果分析［n（%）］Table 1 Analysis of MLPA test results of aborted embryos［n（%）］

表2 不同年龄段组流产胚胎染色体情况Table 2 Chromosomes of aborted embryos in different age groups

表3 不同孕周组流产胚胎染色体情况Table 3 Chromosomes of aborted embryos in different gestational weeks

3 讨论

自然流产是妇产科常见病症之一，流行病学上最常见的原因是胎儿染色体异常［6］，可能与孕妇年龄、理化因素及遗传因素相关，因此建议自然流产胚胎进行染色体检查［7-8］。近年来，MLPA 技术在妇产科领域的应用有了较大进展，为产前筛查、产前诊断及自然流产的病因分析提供了新的技术方法。

有研究发现有超过61%的染色体异常检出率［9］，这可能是因为研究群体不同结果的差异。本研究发现染色体非整倍体畸变占所有异常染色体的96.49%，以47，XN，+16 最为常见，其次为47，XN，+22 和45，XO，这三种异常占非整倍体异常的41.30%，同时还发现染色体单体、染色体双三体、嵌合体和其它复杂染色体非整倍体畸变等。有研究显示，大部分染色体非整倍体畸变来源于卵母细胞减数分裂，尤其是第一次减数分裂时染色体不分离［10］，只有约0～8.5%的来自受精卵最初几次的有丝分裂时染色体分离异常［11］。本次研究中，16-三体发生率最高，它发生在母亲的卵母细胞中与其他的小染色体不同，它重组减少和不分离发生的确切机制还有待进一步研究［12］，但有研究显示在父亲的减数分裂错误中，16 号染色体的不分离可能对胎儿非整倍体产生相对影响［13］。45，XO在流产胚胎中的发生率为5.09%，与相关报道相近［14］。45，XO 是唯一已知的可存活单体（Turner综合征），80%是父源性染色体丢失所致［15］。流产病例中还发现1 例45，XX，-4，2 例45，XN，-21，说明常染色体单倍体也可能是引起早孕期流产的原因。在流产胚胎中，发现14 例染色体部分缺失/重复。染色体部分缺失/重复会导致染色体不平衡，其与流产的相关性有待进一步研究。但本研究中未发现涉及1 号染色体的非整倍体畸变，可能由于1 号染色体上涉及胚胎生命的基因较多，在更早期未被发现的流产中已流失。综上，多种类型染色体畸变均有可能导致早期胚胎流产。

孕妇年龄已被证实与生殖细胞非整倍体的发生密切相关，在大于35 岁的孕妇中，卵细胞染色体非整倍体发生率明显较高，确切原因尚未清楚，可能与高龄女性卵细胞减数分裂重组错误、纺锤体聚合蛋白缺陷和Cohesion 蛋白减少等有关［16］，随着孕妇年龄增加，胚胎染色体异常率也逐渐增加。研究发现，在年轻的流产孕妇中（35 岁以下），遗传异常明显较少，其流产原因可能存在其它因素的作用［17］。但在本研究中小于20 岁的孕妇中，其流产胚胎染色体异常检出率到达74.14%，确切原因有待进一步研究，可能与孕妇身体机制尚未发育成熟有关。

流产孕妇孕周小于12 周染色体异常检出率明显高于孕周大于或等于12 周人群，在自然流产发生时孕周越小，染色体异常的可能性就越大。在妊娠早期的流产胚胎染色体异常可能涉及任何一条或多条染色体，但孕周大于12 周的流产胎儿染色体异常大多为13，18，21 三体性和性染色体非整倍体，与在活产儿中能检测到的染色体畸变类型相似［18］。

自然流产与多种因素相关，其中染色体非整倍体畸变是早期自然流产最常见的遗传学病因。孕妇小于20 岁时，其流产胚胎染色体异常检出率相当高，孕妇在大于35 岁后，随着年龄增大，流产胚胎染色体异常检出率越高［19］，所以适龄婚育相当重要。流产发生时的孕周越小，流产胚胎染色体异常检出率越高，所以，对早期自然流产胚胎进行遗传学检测对明确病因及进一步优生优育咨询具有重大意义。