宫腔内灌注自体培养外周血单个核细胞对反复种植失败患者妊娠结局影响的Meta分析

谭艳，龙文香，周春慧，李娟娟，杨章莉

反复种植失败（recurrent implantation failure，RIF）是指经历3次及以上移植周期，且累计移植至少4枚优质胚胎未获得临床妊娠[1]，是辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）中亟待解决的难题之一。胚胎着床障碍、滋养细胞侵袭能力和子宫内膜容受性不良被认为是RIF最重要的原因[2]。由于基质细胞与滋养层细胞间复杂的内分泌和免疫调节关系在胚胎植入过程中发挥重要作用，有学者尝试用不同的免疫学方法进行治疗，以期提高RIF患者的胚胎种植率[3-4]。宫腔内灌注自体培养外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）是近年生殖医学领域开展的RIF细胞治疗方法之一。就宫腔内灌注PBMC对RIF患者妊娠结局影响的相关文献进行Meta分析，探讨其在RIF治疗中的应用价值和意义。

1 资料与方法

1.1 文献检索电子检索PubMed、Medline（via.OvidSP）、Embase、The Cochrane Library、中国知网（CNKI）、万方数据库（WanFang Data）、维普信息资源系统（VIP）等各大数据库，检索时限从建库至2020年1月，并手工检索所有纳入主要研究的参考文献和引文，查询更多最初电子检索未发现的相关文献。此外，还检索了包括临床试验注册表和会议记录等灰色文献。中文检索词包括：外周血单个核细胞、淋巴细胞、宫腔灌注、反复种植失败、反复着床失败、白细胞、反复植入失败、辅助生殖技术、体外受精、胚胎移植、IVF-ET、ART、ICSI等；英文检索词包括 ：Lymphocyte、LIT、immunotherapy、immunological therapy、implantation failure、RIF、Peripheral blood mononuclear cells、PBMC等，以及上述检索词的自由组合检索。

1.2 文献纳入与排除标准纳入标准：①研究类型为随机对照和队列研究，②体外受精（IVF）周期中3次或3次以上种植失败、且接受宫腔内灌注PBMC的患者。排除标准：研究类型不符、资料不全、无法提取原始数据、失访人数＞20%以及重复的文献。

1.3 数据提取和质量评估两位独立评审员根据纳入标准筛选文献，如有分歧通过与第三位审查员讨论决定。使用自制数据收集表，从选定文献中提取数据。研究中的偏倚风险采用Cochrane风险偏倚工具进行评估。

1.4 统计学方法采用Cochrane协作网的RevMan5.3软件进行统计分析，对提取的数据进行定量统计，合并后绘制森林图。采用χ2检验分析纳入文献间的异质性，检验水准设为α＝1，结合I2判断异质性大小。若P＞0.05且I2＜50%，提示各研究结果间同质性较好，采用固定效应模型进行Meta分析；若P≤0.05且I2≥50%，提示各研究结果间存在异质性，对其进行异质性分析，若无法解决或无法判定异质性来源，采用随机效应模型进行Meta分析。

2 结果

2.1 文献检索结果文献具体筛选流程见图1。数据库初检684篇文献，经评估筛选后，最终纳入12篇文献[5-16]，其中5项为随机对照研究，7项为队列研究，随机对照研究采用Cochrane风险评估方法，队列研究采用NOS评分方法进行风险评估，所有文献均被评估为偏倚低风险。纳入文献基本信息及质量评价结果见表1。

图1 文献检索流程图

2.2 胚胎种植率共纳入9篇文献[6-10，12-13，15-16]（PBMC组780例和对照组793例），各研究间存在异质性（P=0.004，I2=64%），采用随机效应模型进行Meta分析。接受PBMC治疗患者的胚胎种植率高于对照组，差异有统计学意义（RR=2.24，95%CI：1.42～3.54；P＜0.01）。见图2。

表1 纳入文献基本信息及质量评价结果

2.3 临床妊娠率共纳入12篇文献[5-16]（PBMC组635例和对照组535例），各研究间无明显异质性（P=0.12；I2=34%），采用固定效应模型进行Meta分析。接受PBMC治疗的患者临床妊娠率是对照组的2.91倍（RR=2.91，95%CI：2.21～3.87，P＜0.001），见图3。

2.4 活产率共纳入5篇文献[6，8，10，12，15]（PBMC组290例和对照组284例），各研究间无明显异质性（P=0.10，I2=49%），采用固定效应模型进行Meta分析。接受PBMC治疗的患者活产率高于对照组（RR=2.25，95%CI：1.62～3.12，P＜0.001），见图4。

2.5 流产率共纳入4篇文献[7-9，16]（PBMC组102例和对照组38例），各研究间无明显异质性（P= 0.27，I2=23%），采用固定效应模型进行Meta分析。结果显示PBMC治疗组与对照组间流产率比较差异无统计学意义（RR=0.48，95%CI：0.20～1.17，P＞0.05），见图5。

3 讨论

图2 PBMC治疗组和对照组胚胎种植率的Meta分析森林图

图3 PBMC治疗组和对照组临床妊娠率的Meta分析森林图

图4 PBMC治疗组和对照组活产率的Meta分析森林图

图5 PBMC治疗组和对照组流产率的Meta分析森林图

在ART中，随着控制性卵巢刺激（controlled ovarian stimulation，COS）方案的不断完善和胚胎实验室技术及条件不断提高与改善，IVF/胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）周期的种植率、临床妊娠率得到了显著的提高，分别达到30%～40%、50%～60%[17]。但是，在IVF/ICSI 助孕治疗中，RIF发生率仍占IVF/ICSI治疗的5%～10%，是影响IVF/ICSI临床结局的重要原因之一[17]，也是ART领域面临的难题和挑战。引起RIF的病因复杂，涉及遗传、内分泌、免疫、子宫微环境及血栓前状态等，目前的治疗方法主要包括内膜搔刮、胚胎续贯移植、免疫制剂、胚胎植入前遗传学筛查（pre-implantation genetic screening，PGS）等，但均存在治疗指征及临床疗效上的争议[18]。胚胎着床需要优质的胚胎，良好的子宫内膜容受性及胚胎与内膜的相互作用。有研究显示，种植失败2/3的原因归咎于子宫内膜容受性不足，胚胎因素仅占1/3[19]。对拥有高质量胚胎的RIF患者，良好的子宫内膜容受性成为移植成功的关键。通过调节宫腔内免疫微环境提高RIF患者胚胎种植率，直接作用于子宫内膜的治疗方法似乎更加有效。

PBMC由具有圆形细胞核的外周血细胞组成，包括淋巴细胞[T淋巴细胞、B淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞]、单核细胞、部分树突状细胞及少量其他细胞组成，能调节多种细胞因子[如白细胞介素1α（IL-1α）、IL-1β、肿瘤坏死因子α（TNF-α）]的产生，促进滋养细胞基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、整合素αVβ3、子宫内膜血管内皮生长因子（VEGF）和白血病抑制因子（LIF）的产生，提高滋养层细胞对黄体和子宫内膜的侵袭和分化能力，上调子宫内膜容受性[4,9,17]，有利于胚胎发生侵入时的炎症反应，对胚胎的定植起积极作用。同时，宫腔内灌注PBMC局部治疗的全身性排斥反应及感染风险明显低于皮下注射等其他输注途径。相对于已有的分离丈夫或第三方血液中的淋巴细胞进行皮下注射的主动免疫疗法，宫腔内灌注自体培养PBMC无需多次多点注射、无注射部位疼痛、无注射导致的血源性病毒感染风险，其安全、无创、细胞来源充足简单，更容易被患者接受。有学者提出可将PBMC作为一种改善母体免疫识别过程的替代免疫补充剂[18]，但可能会导致有害的子宫免疫过度激活。因此，推荐对RIF患者进行免疫分析和个体化治疗[19]。

2006年Yoshioka等[10]率先采用宫腔内灌注自体培养PBMC治疗RIF，研究纳入4次或4次以上行IVF-胚胎移植（ET）失败的患者35例，取卵当日取自体PBMC，用人绒毛膜促性腺激素（hCG）培养48 h，2 d后再次分离新鲜的PBMC，与培养的PBMC联合灌注于患者的宫腔内，第5天行囊胚移植，结果显示治疗组临床妊娠率、活产率均高于未治疗组，因此提出宫腔内灌注PBMC可能是改善RIF患者胚胎着床的有效治疗方式。Yu等[20]通过动物实验发现hCG在培养PBMC时可诱导其表达IL-1β和TNF-α，以此增强胚胎的侵袭能力，LIF等代表内膜容受性的细胞因子的表达比对照组明显增高；动物模型研究显示给予着床障碍小鼠宫腔灌注与hCG共同培养的PBMC可通过上调子宫内膜容受性提高胚胎种植率和临床妊娠率。但也有学者认为，宫腔灌注PBMC并不能改善2次以下IVF-ET失败患者的临床结局[12,15]。可见，宫腔内灌注自体培养PBMC最为恰当的时机需进一步研究。

在妊娠过程中，母胎之间必须通过子宫蜕膜组织建立血液循环及物质交流屏障，在妊娠早期，黄体细胞表面表达人类白细胞抗原DR及淋巴细胞功能抗原3，提示黄体细胞与T淋巴细胞存在某种信息交流，妊娠妇女的PBMC能刺激黄体细胞分泌孕激素，进而促进宫腔内胚胎植入[21]。Lédée等[22]研究显示，与自体PBMC共同培养48 h之后，非妊娠和妊娠妇女均可观察到黄体细胞分泌的孕激素含量明显增加，且能促进黄体细胞分泌孕激素的IL-10和IL-4的含量也有所升高，说明自体PBMC可以促进黄体细胞的功能及分化。这些研究结果都预示着自体PBMC有助于母胎间的血管组织重建，并且在胚胎种植的过程中与子宫内膜组织协同建立母胎物质交流的屏障。

综上所述，RIF的病理生理非常复杂，而宫腔内灌注自体培养PBMC经多次研究，提示其可有效提高RIF患者的妊娠率，并改善其妊娠结局。在此基础上，本研究Meta分析宫腔内灌注自体培养PBMC治疗RIF的临床效果，共纳入12篇文献，包括1 170例RIF患者。结果显示，PBMC组的胚胎种植率是对照组的2.24倍、临床妊娠率是对照组的2.91倍，活产率是对照组的2.25倍，表明胚胎移植前宫腔内灌注自体培养PBMC可显著改善RIF患者移植后的妊娠结局。

本研究的不足之处在于研究类型不统一，干预措施不统一，比如体外是否含hCG的培养，PMBC灌注的剂量、体积和时间不统一，移植胚胎的胎龄和数量不统一，是新鲜胚胎移植还是冻融胚胎移植不统一。另外，小样本研究设计或患者群体的实质性差异也会影响本次Meta分析的结果。对于宫腔内灌注自体培养PBMC的具体作用机制及长期疗效现尚未完全明确，因此还需进一步对此项治疗方式进行更加细化和精准的研究。