六硝基六氮杂异伍兹烷对体外哺乳动物细胞致突变性研究

赵彬　范小琳　卢青　刘志永　高俊宏

摘 要：目的：通过体外哺乳动物细胞TK基因突变试验和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验研究六硝基六氮杂异伍兹烷（CL-20）的细胞致突变性。方法：在非代谢活化（-S9）和代谢活化（+S9）条件下，CL-20处理L5178Y细胞和CHL细胞，进行基因突变试验和染色体畸变试验。结果：以500、250、125?g/mL浓度的CL-20处理L5178Y细胞，各剂量组突变频率（MF）具有剂量相关性，且500?g/mL剂量组的MF是溶剂对照组的2倍以上;以500、250、125?g/mL浓度处理CHL细胞，各剂量组染色体畸变细胞率与溶剂对照组比较，差别无统计学意义（P>0.05）。结论：CL-20可能对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因具有致突变性，对中国仓鼠肺CHL细胞染色体无致突变性。

关键词：六硝基六氮杂异伍兹烷（CL-20）;TK基因突变;染色体畸变

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

CL-20由中国近代化学研究所提供。

L5178Y TK+/-3.7.2C小鼠淋巴瘤细胞、CHL中国仓鼠肺细胞，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

RPMI1640培养基，马血清购自GIBCO公司，秋水仙碱、Giems等均购自成都格雷西亚化学技术有限公司，三氟胸苷（TFT）、甲基甲烷磺酸乙酯（MMS）、环磷酰胺（CP）等均购自Sigma公司。

洁净工作台（西安富康空气净化设备工程有限公司），CO2恒温培养箱（美国SHELLAB公司）、倒置显微镜（德国蔡司公司），低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 基因突变试验

取清除自发突变，生长良好的细胞，调整密度为5×105/mL，按1%体积加入受试物（需代谢活化的情况下，同时加入终浓度为1%的S9混合物），37℃振摇处理3h，以1000r/min的速度离心5min，弃去上清液，用PBS洗涤，重悬，并调整密度为2×105/mL。

取适量上述细胞悬液，稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔0.2mL），每个剂量种1块平板，培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数。

取适量上述细胞悬液，作2d表达培养，每天计数细胞密度并保持密度在106/mL以下。

表达培养结束后，取适量细胞悬液，稀释至8个细胞/mL，接种96孔板（每孔加入0.2mL），每个剂量种1块平板，培养12d，计数每块平板有集落生长的孔数。

表达培养结束后，另取适量细胞悬液，调整细胞密度为1×104/mL，加入TFT，混匀，接种96孔板（每孔加入0.2mL），每个剂量作3块平板，培养12d，计数有突变集落生长的孔数。

1.2.2 染色体畸变试验

取生长良好的1×106个细胞接种于培养瓶中，置于培养箱内培养24h后，加入一定浓度受试物（需代谢活化的情况下，同时加入终浓度为1%的S9混合物）。置于培养箱内处理6h。处理结束后，吸除培养液，用PBS洗涤，加入完全培养液，放回培养箱，24h后收获细胞。收获前4h，加入秋水仙素溶液。收获细胞后，低渗、固定、滴片、染色后制成染色体标本。显微镜下随机观察不少于200个分散良好的中期分裂相。

1.3 数据处理与结果分析

1.3.1 数据处理

平板效率（PE0、PE2）：

式中：

EW-无集落生长的孔数;

TW-总孔数;

1.6-每孔接种细胞数。

相对存活率（RS）：

突变频率（MF）：

式中：

EW-无集落生长的孔数;

TW-总孔数;

N-每孔接种细胞数（2000）;

PE2-第2天的平板效率。

1.3.2 结果分析

采用SPSS22.0软件进行统计学分析。基因突变试验受试物的突变频率比阴性对照高2倍或以上，并有剂量效应，可判定为阳性结果。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 CL-20对L5178Y细胞基因突变试验

CL-20对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因的致突变性结果见表1。由表1可知，在不加或加S9活化情况下，相对存活率（RS0）随着剂量的增加而减小，说明CL-20对L5178Y细胞具有一定毒性，且呈现剂量--反应关系。阳性对照MMS的MF显著高于溶剂对照组。随着CL-20处理剂量的增加，MF呈上升趋势，具有剂量相关性，且500?g/mL剂量组的MF是溶剂对照组的2.02和2.76倍。

2.2 CL-20对CHL细胞染色体畸变试验

CL-20对仓鼠肺CHL细胞染色体的致突变性结果见表2。由表2可知，在本实验条件下，在有S9和无S9情况下，阳性对照组染色体畸变细胞率均明显增加，分别与溶剂对照组比较差别有统计学意义（P<0.05）。而CL-20低、中、高剂量组染色体畸变率与溶剂对照组比较，差别无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

本次实验采用的是具有较高的检出灵敏度、较广的检测谱且简便易行的体外短期致突变试验方法。实验选取的CL-20剂量为500、250、125?g/mL，在此剂量下，CL-20可能对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞TK基因具有致突变性。而在相同剂量条件下，CL-20对仓鼠肺CHL细胞染色体无致突变性。遗传毒性试验检测方法众多，根据试验检测的遗传终点可分为三类：检测基因突变;检测染色体畸变和检测DNA原始损伤。由于没有任何单一的检测方法能涵盖所有的遗传学终点，因此需要采用体内和體外多种试验方法组合全面评估受试物的遗传毒性风险。在前期研究中，我们通过Ames试验、小鼠骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验，发现CL-20可能具有遗传毒性。本次体外基因突变试验结果，进一步证明了CL-20具有一定遗传毒性。

体外哺乳动物细胞基因突变试验和体外哺乳动物细胞染色体畸变试验可以用于筛选可能的哺乳动物致癌物。因此本次试验结果表明，CL-20可能具有潜在的致癌性，应进一步进行致癌实验研究。

通过此次试验研究，进一步证明了CL-20的致突变性，完善了其毒性安全性评价基础资料，为进一步开展工作场所职业接触限值提供参考。同时提示科研、生产人员接触CL-20应加强防护，避免职业危害。而本次试验未对CL-20的致突变机制进行探讨，今后可开展相关机制研究，为对其安全防护工作提供一定理论支持。

参考文献：

[1]曾贵玉，聂福德，刘晓东，等.六硝基六氮杂异伍兹烷（CL-20）的研究进展[J].含能材料，2000，8（3）：130-134.

[2]郝卫东，李斌，彭双清，等.化学品测试方法：健康效应卷[M].北京：中国环境出版社，2013.

[3]肖凯，李宏霞.遗传毒性试验方法应用现况与研究进展[J].现代预防医学，2004，31（4）：524-526.

[4]马华智，施畅，石富江，等.多遗传学终点的遗传毒性试验组合的建立[J].癌变·畸变·突变，2013，25（6）：465-469.

[5]杜文霞，刘亚杰，王玉玲，等.六硝基六氮杂异伍兹烷的致突变性和致畸性研究[J].中华劳动卫生职业病杂志，2007，25（1）：41-42.

作者简介：

赵彬（1990- ），女，河南焦作人，硕士，助理工程师，研究方向：毒理学。