酶解-超声偶联法提取桔梗茎叶总黄酮的工艺研究

许一平 王新功 梁伟玲 李璐 宋昕(山东中医药高等专科学校，山东 烟台 264199)

0 引言

桔梗(Platycodon grandiflorum(Jacq.) A. DC.)为桔梗科桔梗属多年生草本植物，是药食同源的传统中药[1]，其根为药用部位，主要含有三萜皂苷、黄酮类化合物等活性成分。桔梗茎叶是桔梗的地上部位，现代研究表明，桔梗茎叶中含有皂苷类、黄酮类等活性成分，其提取物具有明显的抗炎、祛痰等生理活性作用[2-3]，其中的黄酮类化合物具有广泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤及抗氧化活性等[4]。文章以总黄酮得率作为评价指标，采用纤维素酶-超声波偶联提取桔梗茎叶中总黄酮，在考察单因素的基础上，采用正交试验设计优化提取工艺条件，为进一步开发和利用桔梗非药用部位资源桔梗茎叶提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

桔梗茎叶采摘于山东省烟台市本校中草药种植基地，经山东中医药高等专科学校中药鉴定教研室王苏丽教授鉴定为桔梗科桔梗属植物桔梗的茎叶。将采收的新鲜桔梗茎叶除去杂质，用纯水洗净后，置干燥箱中50℃干燥，取出粉碎，过100目筛，备用；芦丁标准品(中国药品检定研究院)；纤维素酶(3×104U/g)(安徽博美生物科技有限公司)；乙醇，氢氧化钠，亚硝酸钠，硝酸铝(天津市科密欧化学试剂有限公司)；试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器

KQ3200E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TU-1901型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；FZ102型微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；GZX-9246MBE型电热鼓风干燥箱(上海博迅医疗设备厂)；RE-2000A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-Ⅲ型循环水式真空泵(上海亚荣生化仪器厂)；HH-4型数显恒温水浴锅(金坛市城东新瑞仪器有限公司)；BSA224S-CW电子天平(北京赛多利斯有限公司)；Satorious PB-10酸度计(德国赛多利斯贸易有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 标准品的制备

精密称取115℃干燥至恒重的芦丁标准品10mg，用60%乙醇充分溶解并定容至50mL容量瓶中，摇匀，得浓度为0.2mg/mL的芦丁标准溶液。

1.2.2 标准曲线绘制

精确移取芦丁标准溶液0.0、0.5mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL，分别置于10mL容量瓶中，用60%乙醇补充至5mL，加5%亚硝酸钠0.5mL，混匀静置6min，再加10%硝酸铝0.5mL，混匀，放置6min，加4%氢氧化钠4.0mL，以60%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min。以试剂为空白对照，在510nm波长处分别测定吸光度。以吸光度值Y为纵坐标，以对照品溶液质量浓度X(mg/mL)为横坐标，得到标准曲线的回归方程为Y=13.8436X+0.00015，r2=0.9999。

1.2.3 桔梗茎叶总黄酮的提取

(1)桔梗茎叶样品预处理：将过筛的桔梗茎叶药材粉末用石油醚超声提取30 min,弃去石油醚，滤渣挥干石油醚，干燥后冷却备用。

(2)桔梗茎叶酶解-超声偶联法总黄酮的提取：准确称取桔梗茎叶粉2.0g，置于125mL具塞锥形瓶中，加入一定量的纤维素酶和一定料液比及一定体积分数的乙醇溶液，用酸度计调节溶液pH值均为5.0[5-6]，在恒温水浴锅中以一定温度、时间条件下酶解，15min搅拌1次。待酶解完成后设置超声波的相关条件，在一定的温度和时间下超声提取，抽滤，定容100 mL，得供试品提取液。

(3)桔梗茎叶总黄酮的测定：准确吸取1mL供试品提取液于10mL比色试管，按1.2.2标准曲线绘制项下显色方法各取3份进行平行测定，记录吸光度值，依据标准曲线，计算样品中总黄酮的含量，并按下式计算总黄酮得率：

式中：C为总黄酮质量浓度(mg/mL)；n为提取液稀释倍数；V为提取液的体积(mL)；m为桔梗茎叶的质量(g)。

(4)单因素试验：分别考察纤维素酶用量：0.3%，0.6%，1.0%，2.0%，3.0%，酶解温度：45，50，55，60，65℃；酶解时间：1h，1.5h，2h，2.5h，3h；料液比：1:10g/mL，1:15g/mL，1:20g/mL，1:25g/mL，1:30g/mL；乙醇溶液体积分数：40%，50%，60%，70%，80%；超声温度：40℃，50℃，60℃，70℃，80℃；提取时间：20min，30min，40min，50min，60min。按1.2.3.2下提取方法，分别进行单因素试验。考察各因素对桔梗茎叶中总黄酮得率的影响。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶用量对总黄酮得率的影响

由图1可以看出，由于纤维素酶能破坏细胞壁，有助于总黄酮的溶出，随着纤维素酶用量的增加，总黄酮得率逐渐升高，在酶用量为0.6 %时有最大得率，但随着酶用量的增加，过多的酶由于黏附作用，阻塞黄酮的溶出通道，使总黄酮得率呈下降趋势。故较适宜纤维素酶用量为0.6%。

图1 酶用量对总黄酮得率的影响

2.1.2 酶解温度对总黄酮得率的影响

由图2中可知，总黄酮得率随温度升高而增加，当温度55℃时，总黄酮得率达到最高值；继续升温，由于过高的温度会破坏纤维素酶的活性使总黄酮的得率降低，还可能导致黄酮类化合物部分分解，从而降低总黄酮得率[7-8]。 因此，适宜的酶解温度为55℃。

图2 酶解温度对总黄酮得率的影响

2.1.3 酶解时间对总黄酮得率的影响

由图3中可知，随着酶解时间的增加，总黄酮得率逐渐升高，当酶解时间为1.5h时，总黄酮得率达到最大，随着酶解时间的增加得率降低。因此，适宜的酶解时间为1.5h。

图3 酶解时间对总黄酮得率的影响

2.1.4 料液比对总黄酮得率的影响

由图4可知，随着料液比增大桔梗茎叶总黄酮得率增高，当料液比为1:20时总黄酮得率最大，之后料液比越大总黄酮得率呈降低的趋势。因此，料液比1:20为佳。

图4 料液比对总黄酮得率的影响

2.1.5 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

乙醇溶液体积分数不同，极性不同。由图5可知，总黄酮得 率随着乙醇溶液体积分数的是先增加后减少，故乙醇体积分数为60%较适宜。

图5 乙醇体积分数对总黄酮得率的影响

2.1.6 超声温度对总黄酮得率的影响

由图6可知，随着超声提取温度的升高，总黄酮的得率呈增加趋势，温度超过50℃以后，总黄酮得率有所下降，故取50 ℃为最佳超声温度。

图6 超声温度对总黄酮得率的影响

2.1.7 超声时间对总黄酮得率的影响

由图7可知，总黄酮得率随超声时间延长而逐渐升高，40min后变化趋于平缓，从节能省时的角度考虑，选取超声时间40min较适宜。

图7 超声时间对总黄酮得率的影响

2.2 正交试验及结果

2.2.1 正交试验设计

根据单因素实验结果进行综合分析，选取酶用量、酶解时间、酶解温度、料液比因素，以桔梗茎叶中总黄酮得率为指标，进行L9(34)的正交试验。正交试验因素水平见表1，正交试验结果见表2。

表1 L9(34)正交试验因素水平

表2 正交试验结果

2.2.2 正交试验结果分析

由表2的极差分析可知，各因素对桔梗茎叶中总黄酮得率的影响主次顺序为：酶用量＞酶解温度＞料液比＞酶解时间。故酶法-超声偶联提取桔梗茎叶总黄酮的最佳工艺条件为A2B2C2D2，即酶用量0.6%，酶解温度55℃，料液比1:20，酶解时间1.5h。按最佳提取工艺条件验证试验结果见表3。

表3 验证试验结果

3 结语

本研究采用纤维素酶联合超声提取桔梗茎叶中总黄酮，通过单因素和正交试验分析，在超声温度50℃、超声时间40min、乙醇体积分数为60%的条件下，得出最佳的提取工艺为：酶用量0.6%，酶解温度55℃，料液比l:20，酶解时间1.5h。在此提取工艺条件得到桔梗茎叶总黄酮得率为6.35 %。酶法-超声偶联提取桔梗茎叶总黄酮的工艺是一种新型提取方法，其操作简单、快速、提取率高，可为桔梗茎叶中黄酮类化合物的提取研究提供技术参考，为桔梗非药用部位资源的充分利用提供依据。