大曲液化酶活力测定方法比较分析

刘璐(长春医学高等专科学校，吉林 长春 130031)

0 引言

在大曲诸多理化指标检测过程当中，液化力充分反映了大曲微生物以及酶对淀粉的降解能力，有着非常突出的以应用价值。液化淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4 葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量的麦芽糖和葡萄糖，其颜色消失的速度与酶活性有关，据此可以测定液化酶活力。本文尝试对比传统比色法与分光光度法在大曲液化酶活力测定中的应用效果。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

实验所需仪器包括滴定管、恒温水浴锅、自动移液器、试管、烧杯、容量瓶、三角瓶以及分光光度计。实验所需试剂包括淀粉溶液、原碘液、稀释碘液、糊精溶液、磷酸缓冲溶液、盐酸溶液、以及可溶性淀粉溶液。

1.2 方法

1.2.1 比色法

首先精密称取5.0ml 稀释碘液将其加入50.0ml 标准容积试管内，滴加1～2 滴糊精溶液，充分混合均匀备用。精密称取5.0g 剂量大曲粉，经磷酸缓冲液溶解，在40.0℃水浴装置内浸取120.0min，按照15.0min 的间隔时间进行混合搅拌，确保酶液得到完全浸取，大曲自身淀粉完全消化。取上层清液置入容量瓶内，剩余残渣混合磷酸缓冲液研磨，所得样品转移至标准容积100.0ml 容量瓶内，经磷酸缓冲液定容至标准刻度并充分混合均匀，经4 层纱布进行滤过处理，保留滤液备用。取25.0ml 剂量可溶性淀粉溶液(溶液浓度为20.0g/l)以及5.0ml 剂量磷酸缓冲液，加入100.0ml 标准容积试管内，在35.0℃水浴装置内保温10.0min，视大曲温度情况加入相应固体曲浸出液(中温曲的加入剂量为2.0ml，高温曲加入剂量为20.0ml)，加入10.0ml 剂量纯水，充分混合均匀后在40.0℃条件下进行保温，定时取反应液1滴加入含稀释碘液试管内，对颜色变化进行观察，记录自保温开始至碘液颜色与标准颜色一致耗时。定义可溶性淀粉溶液用量为N，可溶性淀粉溶液浓度为n，耗时分钟数为t1，加入固体曲浸出液体积为V，液化时间为t2，则液化力X可以用如下式(1)所示方式进行计算：

1.2.2 分光光度法

首先精密称取10.0g 剂量大曲粉，经磷酸缓冲液溶解，前序处理方法与比色法一致。在此基础之上精密称取1.5g 剂量淀粉，在250.0ml 标准容积容量瓶中定容，制备浓度分别为0g/l、0.075g/l、0.15g/l、0.3g/l、0.45g/l、0.6g/l、0.9g/l 标 准 溶 液，吸 取1.0ml 剂量淀粉溶液加入装有的5.0ml 剂量稀释碘液以及0.5ml剂量盐酸溶液试管内，充分混合均匀，以稀释碘液以及盐酸溶液为空白对照，对吸光度进行测定，并形成标准曲线。精密称取10.0ml 剂量可溶性淀粉溶液(溶液浓度为4.0g/l)、5.0ml 剂量磷酸缓冲溶液以及10.0ml 无菌水溶液，置入150.0ml 标准容积三角瓶内，充分混合均匀后在60.0℃水浴条件条件下维持8.0min。自加入1.0ml 剂量经稀释待测酶液开始计时，充分混合反应，维持10.0min。吸取1.0ml 剂量反应液加入含5.0ml 稀释碘液以及0.5ml 验算溶液试管内，充分混合均匀，在660.0nm 检测波长条件下对吸光度进行测定。定义测定酶样浓度为c，反应过程中加入待测定酶液量的为v，反应时间为t，则淀粉酶活力X可以用如下式(2)所示方式进行计算：

2 结果与分析

2.1 反应时间

2.1.1 比色法

除前期准备工作以外，固体曲浸出液制备耗时为120.0min，成品曲液化力会对液化时间产生直接影响。以高温曲为例，按照式(1)计算所得液化力。

一般情况下，高温曲液化力检验合格标准在0.2g/g*h～0.6g/g*h 范围内。液化力位于底限的情况下，反应时间为150.0min，液化力位于高限的情况下，反应时间为50.0min。假定前期准备阶段以及液化期间反应液制备耗时为30.0min，则合格曲液化力检测时间在200.0～300.0min 范围内，导致部分液化力偏低不合格曲产生，造成检测耗时较长。

2.1.2 分光光度法

除前期准备工作以外，大曲粉浸提前准备工作耗时为15.0min，淀粉溶液配置等相关准备工作可以与酶液提取同期进行。酶液提取耗时为150.0min，预热反应时间为8.0min，酶解反应时间为10.0min，吸光度检测时间为5.0min，因此对淀粉酶活力的测定总耗时为158.0min。由于吸光度大小会直接决定反应底物浓度大小，因此反应时间不受成品曲液化力因素的影响，呈相对固定的状态。

2.2 准确度

以某原料车间粉碎1#、2#高温曲样为实验样品，分别应用比色法以及分光光度法进行检测，对检测结果进行对比，如下表(见表1、表2)所示。结合表1，经比色法测定1#样品液化力均值为0.43g/g*h，可作为测定真实值用于对相对误差进行计算，经分光光度法测定1#样品酶活力均值为0.58U/ml，可作为测定真实值用于对相对误差进行计算。对相对误差进行对比，1#样品以及2#样品比色法测定相对误差均显著高于分光光度法测定相对误差，提示分光光度法对成品曲酶活力的测定准确度优于比色法。

表1 1#样品测定结果对比

表2 2#样品测定结果对比

3 结语

文章利用比色法以及分光光度法对大曲液化酶活力进行测定，并就反应时间以及测定结果准确度进行对比，得出以下两个方面的结论：第一，在反应时间方面，分光光度法对大曲粉酶活力进行检测的反应耗时为158.0min。而传统比色法在耗时长短上直接受成品曲液化力大小的影响，合格曲液化力检测耗时为200.0～300.0min，不合格曲液化力耗时会更长。比色法、分光光度法在检测原理上有较高的相似性，但比色法需要等待淀粉酶将淀粉彻底酶解为蓝紫色消失，而分光光度法在集中反应10.0min 的基础之上直接应用分光光度计对试样颜色深浅变化进行检测，通过评估试样颜色消失速度的方式得到相应的酶活力检测数据，并以吸光度为依据对酶活力进行计算，因此在反应时间上较比色法更具优势；第二，在准确度方面，比色法测定结果相对误差显著高于分光光度法。主要原因是比色法检测过程中需要定时取出反应液加入装设有稀释碘液的试管内，并对颜色变化进行观察，测定需要间隔时间，在试样液化力较大的情况下颜色变化速度快，时间延迟误差无法彻底规避，肉眼观察也可能导致对终点颜色的判断存在误差。由此可见，分光光度法对大曲液化酶活力进行测定的整体效果优于比色法，可进一步推广应用。