基于酶吸附-催化耦合技术的低聚木糖制备研究

顾峰源，蒋倩倩，姚自选，潘 艳，常思源

(南京科技职业学院，江苏 南京 210048)

低聚木糖是由2～7个木糖分子以β-1,4糖苷键结合而形成的功能性低聚糖，是目前所有功能低聚糖中性能最稳定、功能性最强、摄入量最少的益菌因子，其甜味纯正，增值双歧杆菌的功效是其他功能性寡糖类20倍以上。同时，难以被人体消化吸收，能量值几乎为零。因此，低聚木糖在食品、医药和饲料等领域有着广阔的应用前景[1-2]。

玉米芯中木聚糖含量高达35%～40%，是制备低聚木糖的首选原料。目前，低聚木糖的工业化生产基本是采用木聚糖酶酶解玉米芯的方法。木聚糖酶的发酵生产过程中，产生了大量的杂质且组分复杂，所以在低聚木糖制品生产过程中，酶的纯化和产品的精制是下游产品分离必不可少的步骤，这将会大大增加低聚木糖的生产成本。因此，简化木聚糖酶纯化以及产品精制的步骤是降低生产成本的有效手段。

酶吸附-催化耦合技术是近年来针对不溶性底物的酶催化反应发展起来的一种新思路，即利用底物在酶发酵液中特异性的吸附目标酶，而后进行酶催化反应。该耦合过程能有效降低目标酶的分离成本，易于产物有效分离，甚至能一步获得高纯度的产品，从而显著降低产品的生产成本。ZHANG等[3]将吸附-催化耦合技术用于N-乙酰氨基葡萄糖的生产，酶解壳聚糖的产率近100%，N-乙酰氨基葡萄糖产品纯度高达98%。然而，用于低聚木糖生产的木聚糖酶通常来自G11家族，由于缺少底物结合域，G11家族木聚糖酶难以紧密地吸附于底物木聚糖上。来自枯草芽孢杆菌的扩张蛋白(Expansin)与植物的扩张蛋白高度同源，不仅能够松散木质纤维素的天然结构，还能够紧密地吸附于木质纤维素[4]。因此，在前期工作中，构建了扩张蛋白-木聚糖酶的融合蛋白(EXLX:XYN)[5]。本研究对融合蛋白吸附和酶解玉米芯的条件进行优化，以期对吸附-酶解耦合制备低聚木糖提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器设备

融合蛋白生产工程大肠杆菌(E. coli BL21)为本实验室前期构建所得。木糖(X1)、木二糖(X2)、木三糖(X3)、木四糖(X4)以及木五糖(X5)购自Sigma公司。

恒温培养箱(Biolog Microstation，system 4.2)、紫外分光光度计(UNICO，UV-2101C)、高速离心机(HITACHI，CR21G)、压力蒸汽灭菌锅(HIRAYAMA，HVE-50)、高效液相色谱(HPLC，DIONEX，UltiMate 3000)。

1.2 酶液制备

摇瓶LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，初始pH值7.0。固体培养基再加入20 g/L的琼脂。温度121 ℃灭菌30 min。从抗性平板挑菌接种至10 mL液体培养基，温度37 ℃，180 r/min培养过夜。然后按2%的接种量转接至40 mL的三角瓶中。培养2 h后加入诱导剂40 μL，100 mmol/L IPTG。30 ℃诱导8 h后，菌液离心去上清，加等体积缓冲(pH值=6.5)重悬。重悬菌体经超声破碎后离心，破碎上清液即为粗酶液，4 ℃保存。酶活力测定：酶活力单位为每分钟由底物产1 μmol还原糖所需的酶量定义为一个活力单位(U)[6]。

1.3 融合蛋白对玉米芯固体残渣吸附

玉米芯预处理参照Aachary and Prapulla的碱预处理方法[7]。融合蛋白吸附反应为20 mL体系，包含2 000 U的重组融合蛋白破碎上清粗酶液和适量的玉米芯于缓冲液中搅拌吸附。对吸附过程四个重要参数进行优化，优化参数为不同玉米芯浓度(1%、2%、5%、10%和20%)，pH值(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)，温度(4、20、30、40、50 ℃)，时间(30、60、120、180、240 min)。吸附性能通过比较吸附反应前后上清液中木聚糖酶活力，蛋白浓度和还原糖量的变化。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)表征融合蛋白对玉米芯的吸附效率。

1.4 吸附融合蛋白的玉米芯直接酶解工艺研究

吸附有融合蛋白的玉米芯进行直接酶解。对pH值(5.0、6.0、7.0、8.0和9.0)，温度(30、40、50、60 ℃)，时间(12、24、36、48、60 h)等酶解条件进行优化。酶解结束后立即煮沸10 min终止反应，4 500 g离心30 min，上清液即为酶解液。测定酶解液中总糖含量和还原糖含量，分析低聚木糖得率和平均聚合度(DP)。通过薄层层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)对酶解液中低聚木糖组成和含量进行分析。

1.5 分析方法

1.5.1蛋白质浓度测定

蛋白质含量的测定参照Bradford法，以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白绘制蛋白质浓度标准曲线。

1.5.2还原糖含量测定

3,5-二硝基水杨酸法(DNS)测定酶解产物中的还原糖含量。

1.5.3总糖含量测定

取10 mL酶解液，加入10 mL体积分数8%的硫酸，混匀后煮沸2 h，待冷却至室温后用质量分数20%的NaOH中和至pH值为7.0，定容至50 mL后用滤纸过滤，再用DNS法测定滤液中的还原糖含量。

1.5.4薄层层析条件

TLC所用展层剂为正丁醇∶乙酸∶水以3∶2∶1(体积比)混合，室温下展层两次，显色剂为浓硫酸与乙醇以体积比1∶9混合，显色温度为120 ℃，时间5 min。

1.5.5HPLC色谱条件

HPLC分析检测所用色谱柱为Kromasil NH2柱(Kromasil，Sweden)(250 mm×4.6 mm,5 μm)，进样量20 μL，视差检测器，流动相为乙腈∶水=75∶25，流速0.7 mL/min。

计算公式如下：

平均聚合度(DP)=酶解液中总糖含量/酶解液中还原糖含量。

低聚木糖得率(%)=酶解液中总糖含量/底物木聚糖含量×100%。

2 结果与分析

2.1 底物浓度对融合蛋白吸附性能的影响

在吸附温度4 ℃、pH值6.0、时间60 min 的条件下，分别选取底物浓度为1%、2%、5%、10%和20%进行融合蛋白吸附实验。如图1所示，融合蛋白在底物浓度较低(1%～2%)时，吸附量较少。随着底物浓度的提高(5%～20%)，融合蛋白吸附的木聚糖酶活性从64.9 U/mL增加至69.6 U/mL，吸附的蛋白浓度从0.084 g/L增加至0.129 g/L。另一方面，木聚糖酶比酶活却在下降，这说明提高底物浓度造成了杂蛋白吸附在玉米芯上，导致木聚糖酶比酶活下降。因此，5%是融合蛋白吸附最佳的底物浓度。

图1 底物浓度对融合蛋白吸附性能

2.2 吸附pH值对融合蛋白吸附性能影响

在吸附温度4 ℃、时间60 min、底物浓度5%条件下，分别选取吸附pH值5.0、6.0、7.0、8.0和9.0进行融合蛋白吸附研究。如图2所示，当pH值为7.0时，融合蛋白具有最佳的吸附能力(木聚糖酶活性78.8×103U/L和蛋白质浓度0.088 g/L)。融合蛋白的吸附能力在pH值为5.0(48.8 U/mL，0.072g/L)条件下要小于pH值9.0(72.8 U/mL，0.086g/L)。这一结果表明，融合蛋白更适合在弱碱性条件下进行吸附。LIN等[8]报道在pH值7.0条件下，EXLX1具有最优的吸附能力。同时，也有一些报道发现Expansin在pH值4.8以及pH值5.5时具有最佳吸附效果[9]。这些结果表明，来源不同的Expansin可能具有不同的吸附特性。

图2 吸附pH值对融合蛋白吸附性能影响

2.3 吸附温度对融合蛋白吸附性能影响

在吸附pH值7.0、时间60 min、底物浓度5%的条件下，分别选取吸附温度4、20、30、40、50 ℃进行融合蛋白吸附实验。如图3所示，随着温度的升高，吸附的蛋白浓度和木聚糖酶活性分别从0.086 g/L上升至0.101 g/L，以及78.6 U/mL至93.1 U/mL。另一方面，随着温度从20 ℃至50 ℃时，吸附体系中还原糖的量从0.2 mg增加至0.9 mg。还原糖的产生说明随着温度上升，玉米芯残渣已被降解，这将会影响后期低聚木糖产量。因此，融合蛋白最佳吸附温度为20 ℃，此时融合蛋白的吸附效率较高，还原糖的产量较低。

图3 吸附温度对融合蛋白吸附性能影响

2.4 吸附时间对融合蛋白吸附性能影响

在吸附pH值7.0、温度20 ℃、底物浓度5%的条件下，分别以吸附时间30、60、120、180、240 min进行融合蛋白吸附实验。如图4所示，在30 min之内，大部分的融合蛋白(90.3 U/mL)吸附在玉米芯上；当吸附120 min后，融合蛋白吸附的木聚糖酶活力最大(95.9 U/mL)。然而，吸附的蛋白浓度也随着时间的增加而增加，120 min时融合蛋白木聚糖酶比酶活(928.5 U/mg)小于30 min时(987.6U/mg)。结果表明，延长吸附时间更有利于杂蛋白的吸附。因此，30 min为融合蛋白最佳吸附时间。

图4 吸附时间对融合蛋白吸附性能影响

SDS-PAGE分析显示，大量的融合蛋白(90.3%)吸附在玉米芯上，而木聚糖酶XYN则只有13.5%的蛋白保留在玉米芯上，并且大部分蛋白易被清洗液洗脱)。结果表明，添加了扩张蛋白的木聚糖酶能够有效地吸附在玉米芯上。这将有利于融合蛋白从粗酶液中快速地获取，而后直接用于低聚木糖的生产，简化生产步骤。

2.5 酶解pH值对低聚木糖得率的影响

采用底物浓度5%、酶解温度40 ℃、时间24 h，考察不同pH值对酶解效率的影响，结果见图5。pH值是影响木聚糖酶酶活的关键因子，当反应体系的pH值大于8.0或小于6.0时，酶活力下降很快，酶解产物的平均聚合度较大，低聚木糖得率较低。当反应体系的pH值在6.0～8.0时，低聚木糖得率均到达60%以上，在木聚糖酶的最适pH值7.0时达到最高，低聚木糖得率为61.2%，平均聚合度为3.61。

图5 酶解pH值对低聚木糖得率的影响

2.6 酶解温度对低聚木糖得率的影响

在底物浓度5%、酶解pH值7.0、时间24 h的条件下，考察不同温度对酶解效率的影响，结果见图6。低聚木糖得率随着酶解温度的升高而迅速增加，在50 ℃时到达最大值60%，随后低聚木糖得率急剧下降。这可能是由于温度低于酶最适反应温度时，融合蛋白木聚糖酶活性受到抑制，酶解速率较低，造成得率较低。而过高的反应温度提高了酶解速率，同时也提高了酶热失活速率。因此，最适酶解温度为50 ℃。

图6 酶解温度对低聚木糖得率的影响

2.7 酶解时间对低聚木糖得率的影响

在最佳条件下研究酶解的进程曲线，结果如图7所示。

图7 酶解时间对低聚木糖得率的影响

低聚木糖得率随反应时间的延长而逐渐提高，在0～12 h时，低聚木糖得率提升缓慢，12～24 h低聚木糖得率迅速提高，24 h低聚木糖得率达到35%，24 h之后逐渐趋于平缓。这可能是由于初始12 h融合蛋白作用于不可溶玉米芯残渣，破坏玉米芯的固有结构，释放更多的木聚糖组分，酶解效率相对较低；12 h后融合蛋白作用于木聚糖组分，生成短链聚合物。因此，24 h为最适的酶解时间。

2.8 酶解产物的表征

在底物浓度5%、pH值7.0、温度50 ℃和酶解时间24 h的最佳条件下进行酶解反应，以TLC和HPLC对酶解产物进行分析。TLC结果显示酶解产物包含木二糖、木三糖、木四糖和木五糖等低聚木糖，且没有单糖的产生。

酶解产物中木二糖和木三糖分别占总量的45.2%和36.7%。这些结果表明，融合蛋白具有作为低聚木糖生产酶的能力，并且酶解产物无需繁复的精制过程，即可达到低聚木糖产品要求。

3 结论

本研究旨在优化融合蛋白吸附-催化耦合体系，首先考察了玉米芯固体残渣的添加量、吸附温度、吸附pH值、吸附时间等主要吸附影响因素对该吸附体系的影响，以上清木聚糖酶活力的减少量和蛋白的减少量为检测方法，最佳的玉米芯固体残渣的添加量5%、吸附温度20 ℃、吸附pH值7.0、吸附时间30 min，最终90.3%的融合蛋白吸附于玉米芯固体残渣上，并且通过扫描电镜和SDS-PAGE表征吸附效果。其次，考察了玉米芯固体残渣与融合蛋白复合物的添加量、酶解温度、酶解pH值、酶解时间等主要酶解影响因素对该酶解过程的影响，以低聚木糖为目标产物，当底物浓度为5%，最佳的酶解温度50 ℃、pH值7.0、时间24 h，最终低聚木糖得率为47.7%，平均聚合度为2.3。TLC和HPLC分析结果显示，酶解产物主要为木二糖和木三糖，且占总量的80%以上。本研究不仅将为新型吸附-催化耦合产生低聚木糖技术提供依据，而且还为其他低聚糖制备提供方法学借鉴。