外泌体在妇科肿瘤中的研究与应用进展

王 博 王 超

外泌体(exosomes)是细胞释放的一种纳米级囊性结构，直径为30～150 nm，广泛存在于血液、腹水、阴道宫腔灌洗液等体液中。外泌体通过转运核酸、蛋白质、脂质体等内容物，调控细胞间交流，在肿瘤的发生、发展、微环境形成和免疫调控等方面起重要作用。

1 外泌体在肿瘤中的研究与应用

外泌体的内容物可涵盖蛋白质、核酸、脂质体等，内容物的多样性决定了其丰富的功能。外泌体可在细胞间传递功能性内容物，介导细胞间的信息交流，影响肿瘤的发生、发展。外泌体影响肿瘤的功能具体表现为促进肿瘤细胞增殖和转移、影响肿瘤微环境[1]、影响肿瘤免疫调控等。外泌体对肿瘤细胞增殖的影响具有两面性。一方面，肿瘤细胞以外泌体形式排出细胞内的肿瘤抑制因子，维持其生长。例如，膀胱癌细胞释放含有肿瘤抑制因子的外泌体，使细胞内抑制因子含量减少，抑制功能减弱，导致肿瘤增殖进程加快；沉默RAB27A、RAB27B基因的表达可抑制上述外泌体释放，抑制肿瘤细胞增殖[2]。这提示肿瘤细胞的增殖过程可被逆转。另一方面，肿瘤细胞可以通过接受其他细胞来源的外泌体活化下游生长信号通路，促进肿瘤细胞增殖。外泌体通过转移蛋白质和核酸等内容物激活相关信号通路，增强肿瘤细胞侵袭性。外泌体还可以影响细胞外基质蛋白质、细胞间信息交流，以及通过自分泌或旁分泌等方式调节肿瘤细胞的侵袭特性。例如，肝癌细胞外泌体通过转移赖氨酰氧化酶样4(LOXL4)蛋白质，激活黏着斑激酶/类固醇激素受体(FAK/Src)途径，促进肿瘤的转移[3]。从激活的免疫细胞中提取的外泌体，可以通过多种细胞毒性蛋白质和杀伤机制作用于特定的肿瘤细胞，并抑制其转移[4]。

外泌体包含丰富的内容物，具有广泛的应用价值。例如，外泌体内的核酸分子——微RNA(miRNA)、脱氧核糖核酸(DNA)等，可决定细胞的表观特性。目前，部分临床研究已实现通过检测外泌体内核酸分子表达，进行肿瘤的早期诊断。此外，肿瘤细胞产生的外泌体包含大量的蛋白质，例如LOXL4蛋白质[3]、神经细胞黏附分子CD171[5]、基质金属蛋白酶1(MMP1)[6]等，这些蛋白质可以作为治疗靶点，使纳米级分子药物的靶向治疗成为可能。

2 外泌体在妇科肿瘤中的研究进展

目前，外泌体在妇科肿瘤发生、发展中的作用备受关注，相关研究主要聚焦于肿瘤细胞发生和发展、肿瘤细胞微环境调控、免疫调控等。

2.1 外泌体与妇科肿瘤细胞增殖、转移 外泌体对妇科肿瘤细胞增殖、转移的影响，主要取决于其内部所包含的核酸分子和蛋白质的性质和功能。卵巢癌分泌的外泌体中酪氨酸蛋白激酶受体(EphA2)含量较高，通过磷酸化机制富集EphA2，引起EphA2与其配体ephrin-A1的反向信号传导，促进肿瘤细胞增殖[7]。CD171作为细胞迁移诱导物，可触发细胞外信号激酶磷酸化，借助外泌体的运输而增加卵巢癌细胞的侵袭性，与卵巢癌的不良预后密切相关[5]。外泌体内整联蛋白质可促进细胞外基质中纤连蛋白的黏附、组装，从而增强肿瘤细胞极化状态，促进肿瘤细胞的定向黏附运动[8]。MMP1的表达与卵巢癌不良预后密切相关，高转移性卵巢肿瘤细胞分泌的外泌体可使间皮细胞中MMP1表达量显著升高，促进间皮细胞凋亡，从而促进肿瘤细胞转移[5]。核酸是可影响肿瘤侵袭、转移的另一种外泌体内容物。当外泌体携带的核酸分子是肿瘤抑制因子时，该核酸分子可以成为潜在的预后判断指标。子宫内膜癌细胞分泌的外泌体miRNA-148b，可以抑制肿瘤细胞侵袭、转移，当外泌体缺失miRNA-148b时，子宫内膜癌发生侵袭、转移的风险增加[9]。所以，外泌体通过转移其内容物而影响肿瘤细胞侵袭能力的机制或可成为研究肿瘤治疗手段的主要方向，外泌体内蛋白质与核酸分子间的相互作用机制亦值得进一步研究。

肿瘤微环境在肿瘤的侵袭、转移中扮演重要角色，肿瘤细胞及其周围细胞分泌的细胞因子等均可影响肿瘤细胞的生物学行为。肿瘤来源的外泌体可促进骨髓干细胞表达促血管生成表型，依赖“归巢行为”趋向地迁移至靶组织血管床，促进肿瘤转移前微环境的形成[10-12]。卵巢癌来源的外泌体miRNA-21抑制卵巢癌细胞凋亡，阻断内皮细胞释放外泌体miRNA-21，诱导新生血管形成[13-14]。宫颈癌分泌的外泌体通过血管生成抑制蛋白 1(VASH1)通路，促使淋巴管生成，促进肿瘤细胞的淋巴转移[15]。子宫内膜癌外泌体将短发夹样RNA(shRNA)传递给子宫内膜的成纤维细胞，改变成纤维细胞内功能性miRNA表达谱[16]。进一步研究[17]发现，miRNA-148b直接结合下游靶基因DNMT1，阻止肿瘤细胞转移，提示肿瘤微环境在子宫内膜癌的发生中发挥重要作用，揭示了治疗子宫内膜癌潜在的靶点。多发性骨髓瘤细胞携带的Piwi相互作用RNA 823(piRNA-823)可对微环境内的内皮细胞进行“再教育”，以改变肿瘤细胞增殖、侵袭等生物学特性[18]。

此外，细胞通过释放或吸收不同来源的外泌体，调控肿瘤转移前生态微环境形成，发挥促血管和淋巴管生成、促成纤维细胞和间质细胞分化、重塑细胞外基质、调控内皮细胞等作用，影响肿瘤细胞的侵袭性。

2.2 外泌体与妇科肿瘤免疫 肿瘤发生过程中往往产生肿瘤抗原，激发免疫反应。在妇科肿瘤免疫中，肿瘤细胞来源的外泌体通常有促进肿瘤发生、发展的作用，而免疫细胞来源的外泌体则协助多种免疫细胞杀伤肿瘤细胞，抑制肿瘤的侵袭和转移。

在卵巢癌中，巨噬细胞和T淋巴细胞群均可受外泌体调控。上皮性卵巢癌释放的外泌体可以激活巨噬细胞的“促肿瘤增殖”表型[19]，同时，巨噬细胞释放的外泌体内容物miRNA-223可使卵巢癌细胞产生对化学治疗药物的耐药表型[20]。卵巢癌相关巨噬细胞外泌体中富集的miRNA-29a-3p和miRNA-21-5p导致调节性与辅助性T淋巴细胞17(Treg/Th17)细胞群失衡[21]。在卵巢癌患者血清和腹膜液中的外泌体内容物miRNA-1246大量表达，miRNA-1246可操控肿瘤微环境中M2型巨噬细胞表型，促进肿瘤生成。研究者利用癌症基因组图谱(the cancer genome atlas, TCGA)数据分析发现，高表达miRNA-1246的卵巢癌患者总体预后更差。在动物实验中，抑制外泌体中的miRNA-1246并结合化学治疗，可提高卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性，降低小鼠体内的肿瘤负荷[22]，提示外泌体可作为体液免疫治疗和肿瘤耐药治疗的靶点。

研究[23-24]结果证实，外泌体中小型热休克蛋白质(sHSP)与肿瘤免疫相关。在子宫内膜癌和卵巢癌患者的血清和腹膜液中提取外泌体后发现其中的sHSP的表达量增加，且与细胞毒性免疫反应标志物的表达水平呈正相关。早前研究发现，sHSP在小鼠模型中可诱导抗肿瘤免疫反应[23]，抗癌药物可促进肝癌细胞通过外泌体释放sHSP[24]，上述研究提示外泌体可在动物实验和体外介导自然杀伤细胞的抗肿瘤反应。

在宫颈癌动物模型上验证树突状细胞来源的外泌体(dendritic cell derived exosone,DEXO)可以引发体内外抗肿瘤的免疫反应。负载E749-57肽的DEXO能有效促进体外CD8+T淋巴细胞增殖，诱导细胞毒活性，促进IFN分泌。此外，DEXO作为疫苗在体外可促进抗原E7诱导的免疫小鼠脾细胞的免疫应答。值得注意的是，DEXO介导的宫颈癌保护性免疫应答，可以被聚肌胞苷酸诱导，在显著抑制肿瘤生长的同时，提高宫颈癌模型动物的存活率[25]。

外泌体在妇科肿瘤的免疫中有双向作用，对调控机制的进一步研究有助于理解外泌体在肿瘤免疫中的双重角色。

3 外泌体在妇科肿瘤诊治中的应用

3.1 诊断 在妇科肿瘤细胞分泌的外泌体中，部分核酸和蛋白质具有诊断价值，甚至与疾病的临床分型相关。与健康人群相比，卵巢癌患者腹水和腹膜液来源的外泌体中，发现有5种mRNA(CA11、MEDAG、LAMA4、SPINT2、NANOG)和6种miRNA(let-7b、miRNA-23b、miRNA-29a、miRNA-30d、miRNA-205、miRNA-720)的表达存在差异；而卵巢浆液性腺癌患者来源的外泌体表现为miRNA-30a-5p的富集[26-28]。有研究[3, 5]发现，CD171、MMP1的表达与卵巢癌患者的不良预后相关。一种简单的微流体方法(ExoSearch)可检测卵巢癌患者血浆中3种外泌体来源的肿瘤标志物(CA125、EpCAM、CD24)表达，其诊断的灵敏度和特异度与标准Bradford测定法的效果相当[29]。在宫颈癌患者的宫颈阴道灌洗液标本来源的外泌体中，miRNA-21和miRNA-164a表达水平明显升高，促转录因子ATF1和RAS基因的表达明显上调，HOTAIR、MALAT1、MEG3这3种长链非编码RNA水平明显升高[30-32]。在子宫内膜癌患者尿液来源的外泌体中，多个miRNA谱系较正常样本有所改变，而hsa-miRNA-200c-3p明显富集，是有意义的诊断靶点[33]。从子宫内膜灌洗液中提取的外泌体人集聚蛋白CD81、CLD6、RAB8A可有效地进行子宫内膜癌的早期诊断和疾病分层[9]，提示外泌体内容物在妇科肿瘤的早期诊断中具有潜力，可在临床上进一步开展新型、无创、个体化诊断。

3.2 治疗 关于外泌体与妇科肿瘤的研究多聚焦于卵巢癌，涉及药物载体、生物装置、光动力疗法和肿瘤细胞的化学治疗耐药性等方面，外泌体在临床试验中还可作为新的检测手段和治疗方法。

外泌体作为药物载体具有良好的转运特性、循环稳定性和靶向性，相关研究[34]描述了靶向致癌基因KRAS的外泌体生产及其质量检测流程，并提出大规模生产治疗型外泌体的展望。妇科肿瘤常用的化学治疗药物，如多柔比星、紫杉醇，可通过电穿孔、声波促融合等方式被装载入外泌体，稳定地发挥治疗效果[35-36]。在生物装置中，嵌入小鼠腹部三维(3D)支架内的肿瘤外泌体可以模拟转移前微环境，捕获腹膜内卵巢肿瘤细胞，避免肿瘤进展、转移[37]，这一发现为卵巢癌的治疗提供新思路。美国加州肿瘤研究中心利用特殊透析装置吸附外泌体表面抗原、抗体，清除循环血液中的外泌体，并证实不同级别卵巢癌患者血液中的外泌体可以被有效过滤[38-39]。5-氨基酮戊酸光动力疗法(ALA-PDT)可抑制miRNA-34a在细胞内的表达，介导含有高迁移率族蛋白B1(HMGB1)的外泌体释放，从而促进人乳头瘤病毒(HPV)阳性的宫颈癌细胞凋亡，抑制其增殖[38]。

外泌体内容物与肿瘤耐药性密切相关。基质细胞外泌体miRNA-21靶向于卵巢癌APAF1 基因，缺氧刺激下巨噬细胞外泌体将miRNA-223转移至卵巢癌细胞，上述机制可触发卵巢癌细胞对紫杉醇的耐药性[40-41]。含有CRISPR/Cas9的外泌体也可引起卵巢癌细胞对顺铂的耐药性[42]。进一步观察临床样本，发现循环外泌体miRNA-223水平与卵巢癌的复发率呈正相关，与人第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)-磷脂酰肌醇激酶3/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路激活有关[43]，提示阻断相关外泌体的释放，可改变卵巢癌耐药性，亦可通过测定相关外泌体含量评估化学治疗效果。

在临床试验中，外泌体同样应用广泛。在直肠癌、前列腺癌、乳腺癌(临床试验注册号分别为NCT01294072、NCT02702856、 NCT03974204)等实体瘤中，运用外泌体进行诊断检测、疾病分型、药物装载等研究可使患者的诊断、治疗流程更加高效、便捷。对子宫内膜癌外泌体(NCT02797834)和卵巢癌外泌体(NCT03738319)的临床研究正在开展，相关试验主要研究外泌体特性及其内容物在疾病生理病理过程中的作用。上述临床试验均在http://www.clinicaltrials.gov网站备案。

通过外泌体携带药物或外泌体生物装置抑制肿瘤细胞，或利用光动力疗法抑制肿瘤相关外泌体生成，或抑制肿瘤细胞耐药外泌体生成，均为靶向外泌体的治疗拓宽了新思路。外泌体相关临床试验也正有序开展，外泌体有望实现大规模生产，提示了外泌体在临床应用中的巨大前景。

3.3 其他应用 外泌体在术后康复和肿瘤疫苗应用方面的研究也有相关报道。间质细胞来源的外泌体将miRNA-125a转移至内皮细胞，抑制Delta样配体4(DLL4)的表达，促进正常的血管形成[43]，提示外泌体具有促进术后康复的作用。然而，其促血管生成作用可能加快术后残留肿瘤细胞的侵袭进展，外泌体促血管生成的作用机制尚未明确，有待进一步研究。DEXO产生抗宫颈癌细胞的免疫应答，是新型宫颈癌疫苗接种应用的研究方向[25]。关于外泌体相关卵巢癌疫苗和子宫内膜癌疫苗的研究报道较少。

4 展 望

外泌体内丰富的内容物可影响肿瘤细胞的增殖、转移，以及调控肿瘤微环境，故外泌体具有较高的临床应用价值。但是，目前对于外泌体内容物及其机制的研究主要聚焦于miRNA方向，外泌体内蛋白质的功能还有待进一步明确。外泌体的临床应用前景较为乐观，特别是作为生物学标志物在相关体液活检的应用方面更具潜力。目前部分检测方法技术要求较高，外泌体内容物复杂，不适用于临床检测的实际需求，须寻找更多具有诊断价值的靶向分子。虽然外泌体相关的新兴治疗手段多样，但在外泌体中高效装载治疗分子暂时难以实现，同时，外泌体在体内环境的药理学变化尚未得到确切描述。此外，外泌体在妇科三大恶性肿瘤(卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌)中的增殖、转移调控机制未完全明确，仍待进一步研究。