枸杞多糖对DC2.4细胞增殖、抗原吞噬及成熟的影响

张 炜，万巧凤，马 锐，黄 菱，王 丽

（宁夏医科大学基础医学院病原生物学与医学免疫学系，银川 750004）

枸杞为茄科灌木植物，其成熟果实——枸杞子具有滋补肝肾、益精明目的功效。枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）是枸杞子的主要生物活性成分，是由阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖6种单糖组成的一种大分子水溶性多糖。近年来广泛的药理学研究表明，LBP 具有抗氧化[1-2]、抗肿瘤[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、免疫调节[6]和神经保护[7-8]等作用。树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前所知抗原提呈能力最强的专职抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC），参与抗原的识别、加工处理与提呈，在免疫应答过程中发挥至关重要的作用[9]。DC2.4细胞是通过转染癌基因v-myc和v-raf的C57BL/6小鼠骨髓细胞而建立的永生化细胞系[10]，具有很强的吞噬功能，是用于DC研究的一种标准的未成熟细胞系[11]。本研究以未成熟树突状DC2.4细胞为研究对象，通过观察LBP对DC2.4细胞增殖、抗原吞噬及成熟的影响，初步探讨LBP发挥免疫调节作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 DC2.4是将myc和raf癌基因转染至C57BL/6小鼠骨髓细胞而建立的DC细胞株。DC2.4细胞（AY0006）购自上海慧颖生物科技有限公司。

1.1.2 药品 LBP（宁夏启元药业有限公司，纯度＞90%），由宁夏医科大学刘志宏老师课题组惠赠，用含1‰ DMSO的 RPMI 1640不完全培养基配制成1 g·L-1的LBP母液，再用 0.22 μm 滤器（Millpore）过滤除菌后分装，贮存于-20℃备用。1.1.3 试剂 CCK-8试剂盒（东仁化学科技有限公司，货号：CK04）；脂多糖（LPS，Sigma，批号：L-2880）；胎牛血清（Gibco，货号：26010074）、RPMI 1640培养基（Gibco，货号：31870082）；FITC 标记的卵清蛋白（OVA）（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-0283P）、PE标记兔抗鼠CD86抗体（北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-1035R）。

1.2 方法

1.2.1 DC2.4细胞培养 含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，于37℃、5%CO2培养箱中培养DC2.4细胞，隔天换液。观察细胞形态，传代3～4次后，挑选状态良好的细胞备用。

1.2.2 LBP对DC2.4细胞增殖的影响 将DC2.4细胞接种于96孔板，5000个/孔。待细胞贴壁后换用含有5%胎牛血清的1640完全培养液，同步化培养13～14 h后进行不同处理。空白对照组无任何处理；LBP组分别加入终浓度为200μg·mL-1、100 μg·mL-1和 20 μg·mL-1的 LBP（对应高、中、低浓度组）；LPS 组加入终浓度为 5 μg·mL-1的LPS。设置6个复孔/组，在37℃、5%CO2条件下分别培养 12 h、24 h、48 h 后，每孔加入 10 μL CCK-8溶液，在培养箱中继续培养2 h，然后用酶标仪测定570 nm处的吸光值。

1.2.3 LBP对DC2.4细胞吞噬OVA的影响 接种对数生长期DC2.4细胞于12孔板，3×105个/mL，待细胞贴壁后进行不同处理。空白对照组无任何处理；LBP 组分别加入终浓度为 200 μg·mL-1、100 μg·mL-1和 20 μg·mL-1的 LBP，于 5%CO2、37℃条件下培养48 h后，每孔加入终浓度为50 μg·mL-1的 FITC-OVA 无血清培养基 2 mL。再继续培养4 h后，用4℃预冷的PBS液终止反应，经消化、离心后收集细胞，再用预冷的PBS洗涤2次，最后取500 μL预冷PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测吞噬荧光素的吞噬细胞百分比。

1.2.4 LBP对DC2.4细胞成熟标志分子CD86的影响 接种DC2.4细胞于12孔板，3×105个/mL，待细胞贴壁后进行不同处理。空白对照组无任何处理；LBP 组加入终浓度为 100 μg·mL-1的 LBP；LPS 组加入终浓度为 5 μg·mL-1的 LPS；LPS+LBP组加入终浓度为 5 μg·mL-1的 LPS 及 100 μg·mL-1的 LBP。设置3个复孔/组，在 37℃、5%CO2条件下培养48 h后，消化、收集各组细胞。每孔分别加入终浓度为5 mg·L-1的PE标记CD86抗体1 μL，37℃、避光孵育 30 min，然后用预冷 PBS洗3遍，最后取500 μL预冷PBS重悬细胞，用流式细胞仪进行检测。

1.3 统计学方法

数据使用SPSS 17.0软件处理与分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，各组均数比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC2.4细胞的观察

倒置显微镜下观察DC2.4细胞，为贴壁黏附生长细胞，其形态与小鼠骨髓来源的DC形态特征相似，符合不成熟DC的特点[12]。细胞形态如图1所示。

2.2 LBP对DC2.4细胞增殖的影响

CCK-8检测结果显示：空白对照组培养24 h和48 h后，DC2.4细胞增殖（P＜0.05）。加入LPS后，在12 h、24 h及48 h三个时间点，DC2.4细胞均增殖（P＜0.05）。LBP 组高、中浓度组在 12 h、24 h及48 h三个时间点均没能促进DC2.4细胞增殖，增殖水平接近空白对照细胞；低浓度组在24h和48h均可促进DC2.4细胞增殖（P＜0.05）。见图2。

2.3 LBP对DC2.4细胞吞噬OVA的影响

抗原吞噬结果如图3所示，高、中、低浓度LBP均可促进DC2.4细胞吞噬抗原，吞噬细胞百分比分别为28.2%、30.2%和23.3%，均高于空白对照组（18.9%）（P均＜0.05）。

2.4 LBP对LPS诱导的DC2.4成熟标志分子CD86的影响

检测结果如图4所示，单独使用LPS或LBP，均可上调 CD86表达（P＜0.01）；联合使用LPS和LBP后，CD86的表达低于LPS组（P＜0.05）。

3 讨论

DC是机体中最重要的APC，它不仅能激活免疫应答，而且能诱导免疫耐受，发挥着维持机体免疫平衡的重要作用。DC的功能与其所处的发育阶段有着密切的关系——未成熟DC捕获和加工抗原的能力比较强，但提呈抗原的能力非常弱；成熟DC抗原提呈的能力比较强，但捕获和加工抗原的能力非常弱[11]。未成熟DC在摄取抗原或受到LPS等因素刺激后，呈递抗原的能力逐渐增强，而摄取、加工处理抗原的能力逐渐减弱，最终发育为成熟树突状细胞[13]。本实验所用DC2.4细胞是先用GM-CSF转染C57BL/6小鼠骨髓细胞，然后再转染myc和raf癌基因而建立的永生化细胞株，其摄取抗原后可从未成熟状态转变为成熟状态[14]。OVA是抗原吞噬研究中常用的外源性抗原，与异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）偶联后，可被未成熟 DC2.4细胞吞噬。通过流式细胞仪检测吞噬荧光素的吞噬细胞百分率，可间接反映DC2.4细胞吞噬抗原的能力[15]。CD80和CD86是重要的共刺激分子，对T细胞和树突状细胞的相互作用具有重要的影响[16]，在DC成熟过程中，CD86表达上调，使DC与T细胞接触持久而稳定[17]。

本研究结果显示：在LBP对DC2.4细胞增殖影响实验中，100 μg·mL-1及 200 μg·mL-1LBP 在作用12 h、24 h、48 h后均不能促进DC2.4增殖，而 20 μg·mL-1LBP 在 24 h、48 h 均可促进 DC2.4细胞增殖，说明中、高浓度LBP具有维持细胞数量稳态效应。在LBP对DC2.4吞噬抗原影响实验中，20 μg·mL-1、100 μg·mL-1及 200 μg·mL-1LBP均可促进DC2.4细胞吞噬抗原，以100 μg·mL-1LBP促抗原吞噬作用最佳。在LBP对DC2.4成熟影响实验中，LPS和LBP均可上调DC2.4细胞表面CD86的表达，但LPS和LBP联合使用后，CD86的表达低于单用LPS，说明LBP可适度抑制LPS诱导促进DC2.4成熟作用。

综上所述，LBP发挥抗炎免疫调节作用的生物学机制可能与影响DC的功能相关。本实验仅仅初步探究了LBP对DC2.4部分功能的影响作用，下一步将深入探究其对LPS诱导DC2.4的炎症信号转导途径中关键分子的影响以及对共培养的初始T细胞的影响，以期进一步确定LBP发挥抗炎效应的免疫调节机制。