连二亚硫酸钠诱导HT22细胞缺氧复氧模型的制备

王 丹 ， 田春艳 ， 陈桂生 ， 亓 琪 ， 李海洋 ， 田彩红

（1.宁夏医科大学临床学院，银川 750004； 2.宁夏颅脑疾病重点实验室，银川 750004； 3.宁夏银川市第三人民医院，银川 7500044； 4.宁夏医科大学总医院神经内科，银川 750004）

全国第三次死因回顾抽样调查报告指出，脑卒中是我国目前第一死亡及成年人首位致残的原因，同时是全球第二大致死因素、第一大致残因素[1－2]，缺血性脑卒中占脑卒中的 70%～80%，是严重危害人类健康的疾患。缺血性脑血管疾病的研究方法多种多样，利用动物模型比较接近于疾病的病理状态，但由于动物实验周期长、样品量大、花费高、个体差异大，动物模型的制备具有一定难度，从而限制了其应用[3-5]，由于原代培养海马细胞污染率高，建立缺氧/复氧模型存在一定困难，因此小鼠海马神经元细胞（HT22细胞）成为体外细胞实验的良好选择。而体外实验采用细胞培养，利用化学或物理干预措施模拟人体缺血缺氧状态更为便捷，因此细胞缺氧/复氧损伤模型被广泛地应用于神经细胞缺血缺氧损伤的研究[6]。目前公认细胞缺氧合并培养基缺糖能造成体内缺血模型[7]，连二亚硫酸钠（Na2S2O4）是一种氧清除剂，可有效清除细胞培养基质中的氧，且并不会损伤细胞膜[8-9]，且有研究报道[10]，2 mmol·L-1Na2S2O4溶液可保持无氧状态1 h左右，溶液的pH值并无变化，但利用Na2S2O4建立HT22细胞缺氧/复氧模型的文章鲜见报道。因此，本研究应用Na2S2O4建立HT22细胞的缺氧/复氧模型，以HT22细胞形态变化和损伤情况为指标，以期建立一种稳定的HT22细胞拟缺氧性损伤模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HT22细胞（宁夏颅脑重点实验室提供）。

1.2 主要仪器及试剂

超净工作台（SW－CJ－1F型，苏净集团安泰公司），超低温冰箱（U570型，艾本德），小台式离心机（PICO17型，美国 THERMO），CO2培养箱（311型，美国 THERMO），细胞计数器（TC20型，美国BIO-RAD），倒置相差显微镜（TS100型，日本Nikon），CO2钢瓶（咸阳伟丽气体有限公司），电子天平［PL-303型，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］，全波长酶标仪（PowerWave XS2，美国Bio-tek公司），伯乐细胞计数板（BIO-RAD 145-0011，上海硅狄科学仪器有限公司）。DMEM高糖培养基（Hyclone，上海联硕生物科技有限公司），青链霉素混合液（KGY0023，江苏凯基生物技术有限公司），胰蛋白酶（北京索莱宝科技有限公司），胎牛血清（BI，舜冉上海生物科技有限公司），CCK-8检测试剂盒（日本同仁，北京智杰方远科技有限公司），乳酸脱氧酶（LDH）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），Na2S2O4（化学成分纯品，无锡市亚泰联合化工有限公司），PBS（Hyclone，上海研卉生物科技有限公司）。完全培养基配置：44.5 mL DMEM高糖培养基+5 mL胎牛血清+0.5 mL双抗，现配现用。10 mmol·L-1Na2S2O4培养液的配制：0.0174 g Na2S2O4+10 mL DMEM高糖培养基，按所需浓度稀释，现配现用。CCK-8混合液的配置：根据说明书配制，按实际所需配比。

1.3 实验分组及造模方案

设空白对照组（无细胞+完全培养基），正常对照组（细胞+完全培养基），实验组（细胞+完全培养基+Na2S2O4）。以5×104个/mL的细胞浓度接种96孔板，每孔100 μL细胞悬液，待培养24 h后，吸去原液，PBS洗2遍，空白对照组和正常对照组给予换液处理，实验组加入含不同浓度（0.5、1、2、4 mmol·L-1）的 Na2S2O4培养液（每个浓度梯度设6个复孔），置37℃、5%CO2培养箱中培养1 h，然后实验组吸去培养液，PBS洗2遍，给予完全培养基，置37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，进行复氧。倒置相差显微镜分别观察正常对照组和实验组细胞（缺氧1 h，复氧24 h）形态变化。

1.4 CCK-8检测细胞存活率

按预实验结果选取5×104个/mL细胞浓度，每孔100 μL接种96孔板，培养24 h后，给予不同浓度的Na2S2O4缺氧1 h，复氧 24 h后，将正常对照组和实验组细胞吸去培养液（移至新的96孔板，用于测定LDH含量），用PBS清洗2遍，加入CCK-8混合液，每孔110 μL混合液，置于细胞培养箱中孵育，用多功能酶标仪检测CCK-8孵育3 h时的OD值，根据CCK-8说明书计算细胞存活率。细胞存活率=（实验孔OD值-空白孔OD值）/（对照孔OD值-空白孔OD值），选取细胞存活率在50%～60%时的Na2S2O4浓度为最佳。

1.5 LDH含量检测

待Na2S2O4缺氧处理细胞1 h，复氧24 h后，取正常对照组和实验组细胞培养液，置于96孔板中，每孔20 μL细胞培养液，根据LDH检测试剂盒说明书，用2，4－二硝基苯肼显色法在多功能酶标仪上检测450 nm处OD值，并根据说明书计算各组 LDH 含量（U·L-1）。

1.6 统计学方法

数据应用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较用F检验，组内两两比较用LSD-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Na2S2O4对HT22细胞形态学影响

利用倒置相差显微镜，观察20倍镜下细胞形态。正常对照组细胞良好，细胞胞体饱满，排列紧密，轮廓清晰，胞体边缘有光晕，折光性及立体感强，神经纤维广泛连接，连接密集，少许死亡细胞漂浮（图 1A）。0.5 mmol·L-1Na2S2O4实验组可见细胞轻度损伤，少量神经细胞皱缩，部分神经纤维网络变细、皱缩（图 1B）。1 mmol·L-1Na2S2O4实验组可见细胞损伤加重，胞体皱缩，折光性下降，细胞突起减少，死亡细胞增多，部分神经纤维变细，细胞间纤维连接减少，可见漂浮的断裂神经纤维团块（图 1C）。2 mmol·L-1Na2S2O4实验组可见细胞损伤明显加重，细胞皱缩明显，细胞突起明显减少，死亡细胞明显增多，胞体光晕明显减少，神经纤维网络连接减少，可见成块细胞团块和断裂的神经纤维（图 1D）。4 mmol·L-1Na2S2O4实验组细胞损伤更为明显，大部分细胞皱缩、死亡，视野仅可见部分细胞存活，光晕模糊，神经纤维连接明显减少，可见死亡的细胞团块和断裂的神经纤维（图 1E）。

2.2 CCK-8法检测细胞存活率

给予不同浓度的Na2S2O4（0.5、1、2、4 mmol·L-1）进行缺氧损伤1 h，复氧24 h后，加入CCK-8试剂孵育3 h，根据OD值计算所得的细胞存活率分别为（67±16）%、（65±19）%、（53±15）%、（49±0.9）%，依实验需求，细胞存活率在50%～60%为最佳，故选择 2 mmol·L-1的 Na2S2O4进行缺氧/复氧。见图2。

2.3 不同浓度Na2S2O4作用HT22细胞后上清液中LDH含量比较

随着Na2S2O4浓度增高，细胞损伤加重。与正常对照组比较，各浓度Na2S2O4组上清液中LDH均升高（P均＜0.001），其中，2、4 mmol·L-1组LDH高于0.5、1 mmol·L-1组（P均＜0.05），4 mmol·L-1组LDH 高于 2 mmol·L-1组（P＜0.05）。见表 1。

3 讨论

脑缺血性疾病严重危害人类健康，根据病因不同，脑血管疾病可分为缺血性和出血性病变，而缺血性脑血管病具有发病率高、致残率高和复发率高的特点。因受实验室及动物实验限制，建立体外细胞缺血、缺氧/复氧损伤模型成为研究热点。细胞缺氧是多种缺血缺氧性疾病发病的关键环节，建立细胞缺氧模型来模拟疾病关键环节是从细胞和分子水平研究该类疾病的重要方法[11]，而建立体外细胞缺氧模型方法众多，Na2S2O4最早是用于研究红细胞与氧解离的药物，是一种氧清除剂，可有效清除细胞培养基质中的氧，具有操作简单、成模快速、结果稳定等优点[12]，且Na2S2O4不改变溶液pH值，不损伤细胞膜，因此可直接观察Na2S2O4所致的缺氧状态对细胞损伤的情况。但建立不同细胞的缺氧损伤模型所需的Na2S2O4浓度不同，其使用范围 1～20 mmol·L-1均有报道[13-16]。因此，筛选一个合适浓度的Na2S2O4建立HT22细胞缺氧/复氧模型是本研究的目标。

本研究采用不同浓度的Na2S2O4（0.5、1、2、4 mmol·L-1）对 HT22 细胞进行缺氧损伤 1 h，观察复氧24 h后的结果，随着Na2S2O4浓度的增高，细胞损伤越明显，死亡细胞增多，神经纤维广泛溶解、断裂。CCK-8法广泛应用于细胞增殖和细胞毒性实验，其OD值间接反映活细胞数量。本文应用CCK-8检测不同浓度Na2S2O4损伤细胞的存活情况，0.5 mmol·L-1Na2S2O4作用1 h即可对HT22细胞产生损伤，但 0.5 mmol·L-1Na2S2O4与1 mmol·L-1Na2S2O4细胞存活率差异无统计学意义，而2 mmol·L-1Na2S2O4可对细胞产生损伤，使其细胞存活率为50%～60%。LDH含量是反映细胞损伤的一种敏感且较为简便的指标，当细胞凋亡或坏死造成的细胞膜破坏，会使胞浆内的LDH释放到培养液中。因此，可以通过检测培养液中LDH含量反映细胞损伤情况。在本实验中，随着Na2S2O4的浓度增高，培养液中LDH的含量越高，细胞损伤越重，HT22细胞损伤程度与 LDH释放量成正比[17]，此变化与HT22细胞形态学及CCK-8检测的细胞存活率变化相符。

综上所述，本研究利用形态学、细胞存活率及LDH的方法，观察不同浓度Na2S2O4对HT22细胞的损伤情况，依实验需求，细胞存活率在50%～60%为最佳。因此，2 mmol·L-1Na2S2O4处理 HT22细胞，进行缺氧1 h，复氧24 h可建立有效的缺氧复氧损伤模型，为Na2S2O4诱导HT22细胞缺氧/复氧损伤模型的制备提供了依据。