荧光聚合酶链反应检测血液标本快速方法的建立及其在ADRB1单核苷酸多态性分型中的应用

龚如涵，李 佳，黄凯峰

（上海交通大学附属第一人民医院检验医学科，上海 201620）

ADRB1 是β1肾上腺素受体基因，编码β1肾上腺素受体蛋白。β 肾上腺素受体（β-adrenergic receptor）为肾上腺素受体的一个亚家族，属于G 蛋白偶联受体超家族，包含β1、β2和β33 种不同亚型。该类受体与Gs 蛋白偶联后可调节细胞内cAMP 和L 型Ca2+通道的开放频率，是β 受体激动剂和β 受体阻滞剂的作用靶点。研究发现，β1肾上腺素受体基因ADRB1 表达的水平与心力衰竭（心衰）、高血压等心血管疾病的发生、发展及治疗效果密切相关。药物在ADRB1 不同基因型的个体之间会产生不同的药理作用[1-3]。以降压药美托洛尔为例，β1受体编码基因ADRB1 的单核苷酸多态性 （single nucleotide polymorphism,SNP）可影响β 受体阻断剂（如美托洛尔）的疗效。ADRB1 Gly389Arg（rs1801253）多态性导致存在位点Arg389 和Gly389 2 种类型的受体，其中Arg389 型受体与G 蛋白偶联的效率高于Gly389 型受体。Arg389 纯合子高血压患者应用美托洛尔后，血压下降的程度是Gly389Arg 杂合子基因型个体的3 倍；Arg389 纯合子基因型心衰患者应用卡维地洛和美托洛尔治疗后，其左心室射血分数改善情况更佳[4-6]。

对于基因位点SNP 分型，目前主流的方法有实时荧光聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法、焦磷酸测序法、Sanger 测序法、基因芯片法等，不同的方法具有不同的优缺点。如焦磷酸测序虽然分型准确可靠、通量较高，但其测序长度较短，无法对长片段进行分析。Sanger 测序法虽然是基因SNP 分型的“金标准”，但其操作复杂，成本较高，速度较慢。基因芯片法虽然通量高，但其操作复杂，设备依赖性较高。实时荧光PCR 法虽然通量不高，但操作简单、快捷，所用仪器普及度高，也因此受到广大研究者的青睐。然而，传统的荧光PCR 法由于其扩增模板往往需要在进行荧光PCR 检测前对样本（如血液样本）的基因组DNA 进行提取，故在整个检测过程所需时间和操作便捷性方面还存在可提升空间，检测成本也存在降低的潜力。因此，本研究基于传统荧光PCR 法，建立一种新型的采用血液标本直接扩增（直扩）的荧光PCR 方法。

本研究拟建立一种新型的血液标本直扩荧光PCR 方法，其基本原理主要为TaqMan 荧光PCR法。该方法的核心是TaqMan 荧光探针，其是一种寡核苷酸探针，荧光基团连接在探针的5′末端，而淬灭剂则在3′末端。进行PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的5'→3' 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。本研究拟将这种新建立的血标本直扩荧光PCR 方法应用到ADRB1 基因的多态性检测中，观察其临床应用价值。

材料与方法

一、材料

收集上海交通大学附属第一人民医院南院2018 年6 月至2018 年12 月门诊和住院患者的外周静脉乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝全血标本共1 051 份，将血液样本置于2 ℃～8 ℃下保存，并在1 周内进行相关检测。所有纳入的患者均已排除有输血史及骨髓移植史者。本研究经上海交通大学附属第一人民医院伦理委员会批准。

二、方法

1.引物和探针： 根据ADRB1 （1165G＞C）的SNP 位点序列信息，采用Primer Premier 5.0 软件进行引物和探针的设计，其结果见表1。

2.荧光PCR 体系和程序

（1）荧光PCR 体系：荧光PCR 体系包括10 μL 2×快启动直接扩增预混合缓冲液（珠海宝锐生物科技有限公司），0.6 μL 50×快启动直接扩增酶（珠海宝锐生物科技有限公司），0.4 μL dNTP 混合液（各10 mmol/L）（珠海宝锐生物科技有限公司），1 μL抗干扰液（0.05% Triton X-100，生工生物工程有限公司），8 mmol/L Tris-HCl（生工生物工程有限公司），0.5 μL ADRB1 上游引物（10 μmol/L）（委托北京擎科新业生物技术有限公司合成），0.5 μL ADRB1 下游引物（10 μmol/L）（委托北京擎科新业生物技术有限公司合成），0.25 μL ADRB1 野生型探针（10 μmol/L）[委托赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成]，1 μL ADRB1 突变型探针 （10 μmol/L）[委托赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成]，2 μL EDTA 抗凝全血 （上海交通大学附属第一人民医院），并加入纯化水至总体积20 μL。

（2）荧光PCR 反应程序：使用ABI 7500 荧光PCR 仪（赛默飞科技，美国）进行反应，95 ℃预变性5 min；95 ℃、15 s，62 ℃、30 s，共5 个循环；95 ℃、15 s，62 ℃、30 s （设置FAM 和VIC 双通道收集信号），共40 个循环（荧光PCR 实验过程由杭州百迈生物股份有限公司完成）。

表1 ADRB1 引物和探针序列

（3）结果判断：本研究方法的样本阳性判断值为Ct 值33，阳性对照品的阳性判断值为Ct 值30。因此，结果判读前提为，阳性对照品的Ct（FAM）值≤30 且Ct（VIC）值≤30，阴性对照Ct 值显示为无检测信号（undetermined）或Ct 值＞33。目标检测样本的基因型判断标准如下，FAM 通道Ct 值≤33，VIC 通道Ct 值＞33 或无检测信号，则判读为野生型，即ADRB1（G1165G）；FAM 通道Ct 值≤33，VIC 通道Ct 值≤33，则判读为杂合型，即ADRB1（G1165C）；FAM 通道Ct 值＞33 或无检测信号，VIC 通道Ct值≤33，则判读为突变型，即ADRB1（C1165C）。

3.方法学验证：为了验证上述所血标本直扩荧光PCR 法的性能，将其与传统的DNA 提取加荧光PCR 方法进行对比分析。传统的DNA 提取加荧光PCR 方法具体如下。

（1）DNA 提取：采用杭州百迈生物股份有限公司的Koning®快速血基因组DNA 小量制备试剂盒（浙杭械备20170183 号） 进行EDTA 抗凝全血的DNA 提取，并采用分光光度计进行DNA 标本的浓度和纯度检测，浓度要求不低于20 ng/μL，纯度要求吸光度（absorbance,A）260nm/A280nm介于1.8～2.0，A260nm/A230nm比值大于2.0，将合格标本存放于-20 ℃下备用。

（2）荧光PCR 体系：该荧光PCR 体系包括10 μL 2×快启动直接扩增预混合缓冲液（珠海宝锐生物科技有限公司），0.6 μL 50×快启动直接扩增酶（珠海宝锐生物科技有限公司），0.4 μL dNTP 混合液（各10 mmol/L）（珠海宝锐生物科技有限公司），8 mmol/L Tris-HCl （生工生物工程有限公司），0.5 μL ADRB1 上游引物（10 μmol/L）（委托北京擎科新业生物技术有限公司合成），0.5 μL ADRB1 下游引物（10 μmol/L）（委托北京擎科新业生物技术有限公司合成），0.25 μL ADRB1 野生型探针（10 μmol/L）[委托赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成]，1 μL ADRB1 突变型探针 （10 μmol/L）[委托赛默飞世尔科技（中国）有限公司合成]，2 μL DNA，加入纯化水至总体积20 μL。

（3）荧光PCR 反应程序：同“2.荧光PCR 体系和程序”（荧光PCR 实验过程由杭州百迈生物股份有限公司完成）。

（4）结果对比：对比本研究建立的血标本直扩荧光PCR 方法与经过传统DNA 提取环节后所采用的荧光PCR 扩增的扩增图谱信号高低及Ct 值。

4.ADRB1 基因SNP 分型： 利用本研究建立的方法对1 051 例临床血液样本的ADRB1 基因进行分型检测，同时与Sanger 测序法进行对比（Sanger测序由杭州百迈生物股份有限公司完成），评估本研究所建立方法在该基因分型中应用的准确性。同时采用SPSS 14.0 软件 对3 种基因型的符合率进行Kappa 一致性检验，以评估本研究建立的新方法的准确性。

5.统计学处理：采用SPSS 19.0 软件统计对本研究所建立方法的检测结果和Sanger 测序方法的检测结果数据进行分型，统计分析两者间的野生型ADRB1（G1165G）、杂合型ADRB1（G1165C）及突变型ADRB1（C1165C）的符合率。

结 果

一、血标本直扩荧光PCR 方法与传统DNA 提取后定量PCR 方法的对比

以EDTA 抗凝全血为样本，分别采用本研究建立的血标本直扩荧光PCR 方法与传统的DNA 提取后再进行荧光PCR 扩增的方法进行对比，3 种不同基因型的结果见图1～3。图1 为野生型样本，FAM 探针（蓝色）为扩增曲线起峰，以下简称起信号，VIC 探针（绿色）没有信号，即表明本研究建立的方法能够对野生型血液样本进行准确检测；图2为杂合型样本，FAM 探针和VIC 探针同时起信号，即表明本研究建立的方法能够对杂合型血液样本进行准确检测；图3 为突变型样本，VIC 探针起信号，FAM 探针没有信号，即表明本研究建立的方法能够对突变型血液样本进行准确检测。

图1 野生型样本检测对比结果

二、ADRB1 基因SNP 分型

利用本研究建立的血标本直扩荧光PCR 方法对1 051 例临床样本进行分型检测，并与Sanger 测序法这一“金标准”进行对比，其符合率情况见表2。

2 种方法间的G/G 型符合率达98.67%（95%置信区间为0.960～1.000），G/C 型符合率达96.59%（95%置信区间为0.948～0.984），C/C 型符合率达99.65%（95%置信区间为0.992～1.000），总符合率达98.98%（95%置信区间为0.976～0.991）。

图2 杂合型样本检测对比结果

图3 突变型样本检测对比结果

表2 符合率分析结果

进一步对2 种方法之间的Kappa 一致性进行检测，其结果见表3、4。

根据计算，本研究建立的新方法与Sanger 测序法间的ADRB1 基因一致性Kappa=0.971，精确显著性P＜0.001，说明两者对ADRB1 基因检测结果一致性较好。

讨 论

随着PCR 技术的不断发展，无论是在生物学领域还是医学领域，该技术已得到了广泛的应用。伴随PCR 技术的普及，荧光定量PCR 技术受到了广泛的青睐。无论是PCR，还是荧光定量PCR，其技术的应用都离不开扩增模板，即核酸。因此，核酸的提取或纯化是PCR 技术的关键点。目前常用的核酸提取或纯化技术主要包括以下3 类。①传统的酚-氯仿抽提，此方法耗时较长，需3～4 h，且纯化获得的核酸纯度较低；②硅胶柱法抽提，此方法耗时比传统的酚-氯仿抽提短，需1～2 h，其纯化获得的核酸纯度较高；③磁珠法抽提，此方法耗时比传统的酚-氯仿抽提短，需1～2 h，其纯化获得的核酸纯度较高。尽管如此，硅胶柱法和磁珠法虽然在耗时上有所改进，但与后续的PCR 反应时间（约1 h）相比，这些提取方法使得整个核酸检测的总时长延长至单纯PCR 耗时的2 倍。因此，无论是生物实验，还是临床检验，均急需一种简单、快速、高效的方法。

因此，有学者提出了将全血标本直接进行PCR检测的方法，即直接以全血或全血的粗提物进行PCR，并使用抗干扰能力极强的Taq 酶和PCR 缓冲液来实现全血直接PCR。这种方法虽然在定性PCR检测中得到了较好的应用，大大缩短了核酸检测的时间，但却无法在荧光定量PCR 上得到很好的应用。究其原因，是因为荧光定量PCR 需要对PCR 过程中的荧光信号进行采集，而血液中的血红素因为其卟琳环在415～430 nm 处存在吸收光，会对这个过程产生极为严重的干扰，从而导致荧光定量PCR的失败。因此，急需一种能够快速去除全血中血红素干扰的方法，从而为全血直接荧光定量PCR 提供支持。

表3 卡方检验结果

表4 对称度量结果

本研究通过向荧光PCR 体系中加入抗干扰液，减弱血红素对于荧光定量PCR 的干扰，从而实现采用全血标本直扩荧光定量PCR 检测。将本研究建立的新方法与传统DNA 提取加荧光PCR 法比较，结果提示本研究建立的全血标本直扩荧光PCR 法具有较高的扩增效率。此外，本研究所建立的方法，从获得血液样本到完成整个荧光PCR 的耗时为60 min，而传统的DNA 提取加荧光PCR 法则需要120 min 左右，新方法大大缩短了检测时间，提高了检测效率。

在ADRB1 基因分型的临床检测应用中，本研究建立的新方法与Sanger 测序法测得结果间的总体符合率达到98.98%，剩余1.02%的不符合，究其原因，主要在于临床上有少数样本存在一定的特殊性，如白细胞水平极低等情况，导致检测效率不高或影响基因分型结果。对于该类样本，后续可通过白细胞富集的方式提高检测准确率。

目前对于ADRB1 基因分型检测，常用的方法主要有荧光PCR 法、焦磷酸测序法、Sanger 测序法、基因芯片法等，其中最常用的方法是荧光PCR法和Sanger 测序法。本研究所述方法是基于传统的荧光PCR 法所建立的，并在临床ADRB1 基因分型检测中进行了实际应用。通过与Sanger 测序法的结果对比表明，本研究建立的新方法在临床使用中具有很高的准确率。总之，本研究建立的全血标本直扩荧光PCR 法具有准确率高、操作简便等优势，未来有望在临床检验领域推广和使用。