火焰南天竹组培快繁体系的探讨

宋帅杰，黄坤，钱如南，刘峰，林立，陈际伸

(1.汇绿园林建设发展有限公司，浙江 宁波 315800； 2.宁波城市职业技术学院 景观生态学院，浙江 宁波 315502)

火焰南天竹(NandinadomesticaFirepower)属小檗科南天竹属常绿灌木[1]，喜温暖多湿及通风良好的半阴环境，适宜生长在富含腐殖质的沙质壤土上。火焰南天竹植株矮小，茎节较短[2]。待秋季降温时，叶片由翠绿变为鲜红，红叶可持续至翌春，极具观赏价值，在南方园林中使用较普遍[3]。南天竹在园林中多丛植或孤植于花径和庭院，也可做地被及色块植物，是良好的花径与庭院材料，市场需求量较大；同时，南天竹的根、茎、叶均有药用价值[4]。扦插、分株为火焰南天竹常用的繁殖方式，但存在繁殖系数低、品种特性易退化、培育周期较长等缺陷[5]。近年来，随着火焰南天竹广泛应用于城市及乡镇的园林绿化建设中，观赏苗木的需求日益增多，传统的火焰南天竹的繁殖方法已无法满足市场需求[6]。运用组织培养技术进行火焰南天竹繁殖的研究日益增多。根据现有的火焰南天竹组培快繁技术，外植体萌芽率约为30%～50%，生根率不足50%，增殖系数约1～3，且存活率较低，难以满足大规模栽培及工业化生产的需求[7]。为此，通过对比不同灭菌时间、培养基和激素浓度及移栽基质等方面的研究，旨在探索出一套外植体萌芽率高、增殖系数大、生根率高的火焰南天竹快繁技术，为火焰南天竹的产业化的发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 外植体

火焰南天竹购自嘉兴中瑞生物科技有限公司，4月初选取株高约40 cm的长势健壮均匀的实生苗，剪取1～2 cm的茎尖作为组培外植体材料。

1.2 培养基

配置MS、1/2 MS、WPM和B5等基本培养基，并添加不同种类和浓度的外源激素，以及30 g·L-1蔗糖和0.7%琼脂，pH值为5.8，经121 ℃高温灭菌20 min后待用。

1.3 试验方法

1.3.1 灭菌时间对成活率的影响

将生长健壮、无病害的火焰南天竹采回后用肥皂水浸泡5 min，然后用流动水冲洗30 min，切取1～2 cm的茎尖进行灭菌处理。在无菌环境下，先用70%酒精消毒5 s，再用10% NaClO灭菌，分别设定5、8、10、12、15、20 min的灭菌时间，然后用无菌水冲洗3次，用无菌滤纸吸干水分，切取茎尖部分约2 mm，接种到培养基中。7 d后统计其污染率、成活率及死亡率等。

1.3.2 不同培养基和外源激素对不定芽诱导率的影响

采用MS，1/2MS，WPM和B5为基本培养基，外源激素为6-BA(0.5、1.0和1.5 mg·L-1)、NAA(0.1、0.2和0.5 mg·L-1)和IBA(0.1 mg·L-1)，活性炭(AC)1.0 g·L-1，其他条件为蔗糖30 g·L-1，琼脂粉6.0 g·L-1，pH值5.8。将灭菌处理后的火焰南天竹茎尖迅速接入诱导培养基中，每处理10瓶，每瓶接6个，30 d后统计诱导率。

1.3.3 不同外源激素和活性炭对不定芽增殖率的影响

继代增殖培养时，以诱导培养的新芽茎段为材料，以MS为基本培养基，蔗糖30 g·L-1，添加不同浓度的6-BA(0.5和1.0 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2和0.5 mg·L-1)，并添加IAA 0.1 mg·L-1和活性炭1.0 g·L-1，每处理重复3次，每重复50瓶，每瓶接种7个新芽，继代培养3次后统计数据。

1.3.4 IBA浓度和活性炭对生根率的影响

生根培养时，以高2 cm的继代增殖苗为试验材料，以1/2 MS为基本培养基，蔗糖30 g·L-1，分别添加IBA(0.5、1.0和1.5 mg·L-1)和活性炭(1.0、2.0、4.0和8.0 g·L-1)，每处理重复3次，每重复30瓶，每瓶接种10个。

1.3.5 基质对组培苗移栽成活率的影响

选取长势一致的试管苗，将其置于自然光条件下培养3～4 d后打开瓶盖，炼苗7 d后将幼苗取出，洗尽表面琼脂，除去较长的根及部分叶片，移入泥炭土∶蛭石∶珍珠岩配置比例分别为2∶2∶1、3∶1∶1、8∶1∶1的不同营养土中。另一个基质全部由泥炭土组成，盖上薄膜进行保温保湿培养。每日观察、记录移栽苗的生长状况，培养30 d后统计成活率。

1.4 数据统计与分析

用Excel 2007和SPSS 22.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌时间对成活率的影响

研究6个灭菌时间对火焰南天竹茎尖成活率的影响。由表1可知，经10%的NaClO处理外植体5 min，火焰南天竹外植体的死亡率最低，仅为12%，但其污染率最高，达72%；处理20 min后，外植体死亡率高达50%，而污染率为15%；经NaClO处理12 min的火焰南天竹的外植体死亡率为14%，污染率为23%，有效成活率最高，可达63%，效果最佳。

表1 不同灭菌时间对火焰南天竹成活率的影响

2.2 不同培养基和外源激素对不定芽诱导的影响

由表2可知，4种培养基上火焰南天竹的茎芽均有萌发和生长。从诱导率可以看出，不同培养基对火焰南天竹外植体诱导的影响差异显著。以MS为基本培养基的火焰南天竹的不定芽诱导率达到58%，显著高于其他培养基。由此可知，MS培养基较适合火焰南天竹外植体的诱导培养。

表2 不同培养基对不定芽诱导的影响

据初代培养基初选的结果，选择MS为基本培养基，并对6-BA和NAA浓度进行了调整，筛选最适诱导率配方。由表3可以看出，6-BA、NAA和IBA的不同配比均可诱导火焰南天竹的茎段萌发，但诱导率差别较大。其中，6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1的诱导率最高，达87%，显著高于其他处理。当6-BA达到1.5 mg·L-1时，不定芽分化率反而降低，说明6-BA浓度不是越高越好。6-BA 1.0 mg·L-1时，低浓度NAA能诱导不定芽分化，但NAA 0.5 mg·L-1时，芽分化受到抑制。因此，火焰南天竹茎段诱导不定芽最佳激素浓度配比为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1。7 d后其不定芽生长点开始变绿，长出绿色新叶，1个月后可观察到火焰南天竹的丛生苗。

2.3 不同浓度外源激素对不定芽增殖的影响

MS培养基中添加适量的活性炭能促进火焰南天竹不定芽的生长和发育。由表4可知，不同外源激素及浓度下，火焰南天竹的增殖表现不同。低浓度的6-BA不利于丛生芽的增殖，高浓度的NAA易形成愈伤组织，但形成的丛生芽生长缓慢，且茎段难伸长。添加适宜的IAA和活性炭有利于其增殖。由此可知，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IAA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1是火焰南天竹不定芽增殖的最佳组合，增殖系数最高可达5.29。

表3 不同浓度外源激素对不定芽诱导的影响

表4 不同浓度外源激素对不定芽增殖的影响

2.4 不同IBA浓度和活性炭对火焰南天竹生根率的影响

表5表明，火焰南天竹组培苗生根率较高，最高可达98%。每个组培苗平均可长出3～5个不定根，且组培苗生长健壮，长势均匀。一定浓度的IBA和活性炭同时使用可提高组培苗的生根率。不添加IBA和活性炭时，组培苗的生根率较低，最低仅有67%，根系生长缓慢且细小。培养基中加入活性炭可显著提高生根率，随着活性炭浓度的增加，生根率呈先增加后减小的趋势。不加任何激素也能有效促火焰南天竹生根，但根较细且生根所需时间较长。综上所述，1/2 MS+IBA 0.5 mg·L-1+AC 4.0 g·L-1为火焰南天竹组培苗的最佳生根培养基，其组培苗根系粗壮，愈伤组织较少，炼苗成活率较高。

表5 不同IBA浓度和活性炭对火焰南天竹 生根率的影响

2.5 不同的基质对火焰南天竹组培移栽苗成活率的影响

从表6可以看出，不同基质直接影响组培苗的移栽成活率。炼苗7 d后移栽至混合基质泥炭土∶蛭石∶珍珠岩8∶1∶1上的火焰南天竹组培苗移栽成活率最高，达94%；在全泥炭的基质中组培苗移栽成活率最低。此外，从各试验组苗高可以看出，泥炭土含量高的基质，其组培苗生长更快，且叶色浓绿，苗更健壮，但全泥炭影响土壤的透气性和保水性，不利于组培苗生长。

表6 不同基质对火焰南天竹组培苗移栽 成活率的影响

3 讨论

火焰南天竹是一种木本植物，而木本植物再生体系的建立不仅周期长，还具有一定难度。灭菌时间是影响火焰南天竹成活率的重要因素，灭菌时间不足会导致外植体污染率升高、成活率较低。本研究结果表明，10%NaClO对火焰南天竹灭菌12 min的效果最佳。另外，不同培养基和外源激素浓度对火焰南天竹不定芽的诱导及增殖具有重要作用。刘中兵等[8]在南天竹初代培养条件研究表明，MS+6-BA 1.0 mg·L-1+ NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1为南天竹的最佳诱导组合，最高诱导率为74.4%，造成结果差异的原因可能是不同品种的南天竹所需的6-BA不同；邓玉营等[9]发现，当6-BA浓度达0.8 mg·L-1时，组培苗会出现玻璃化现象。所以，培养基中6-BA浓度不宜太高，这与本文研究结果一致。本研究通过不同外源激素浓度对火焰南天竹不定芽诱导的影响结果表明，不同激素配比对不定芽诱导的结果不同，6-BA浓度并非越高越好，当浓度达到1.5 mg·L-1时，火焰南天竹不定芽分化率反而降低，以MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1+AC 1.0 g·L-1组合对火焰南天竹的外植体诱导率最高，可达87%。周志疆等[10]在火焰南天竹组织培养体系建立与优化的研究中表明，火焰南天竹最佳增殖培养基为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1，最高增殖系数为3.5；杜永芹等[11]在耐寒彩叶树种火焰南天竹的快繁技术研究表明，MS +6-BA 1.0 mg·L-1+IBA 0.1 mg·L-1为最佳增殖培养基，最高增值系数为4.12，其增值系数远低于本研究结果(5.29)，分析原因可能是由于基础培养基及外源激素不同对后期组培苗的生长有一定影响。王春等[12]对南天竹进行生根试验表明，添加IBA 0.25 mg·L-1可使南天竹的生根率最高达87.33%。周志疆等[10]以1/2 MS+IBA 0.3 mg·L-1+蔗糖20 g·L-1为生根培养基，生根率可达97%。本研究通过IBA和活性炭对生根壮苗的影响发现，在1/2 MS基本培养基中添加IBA 0.5 mg·L-1和活性炭4.0 g·L-1，可显著提高火焰南天竹的生根率，最高可达98%，且根系粗壮。将组培苗移栽至泥炭土∶蛭石∶珍珠岩为8∶1∶1的混合基质中成活率最高，可达94%，组培苗生长较快、生长健壮、长势均匀且适应性强。生根困难及移栽成活率低是木本组培中比较突出的问题，阻碍了组培快繁技术在生产上的应用与发展[13-14]。在培养基中添加生长素IBA和活性炭可明显促进火焰南天竹形成完整的再生植株。生长素对植物生长发育起促进作用，而活性炭也对培养基中有害代谢产物起到吸附作用[15]。另外，组培苗的移栽同样是组培的关键环节，直接影响到组培苗的成活和质量。

本研究所构建的一套高效的火焰南天竹组培快繁体系表现出增殖系数高、培育周期短、组培苗抗逆性好、移栽成功率高的优点，接下来在移栽时期、各阶段所需用肥种类及配比等方面还需深入研究。