基于响应面法的马比木中喜树碱提取工艺的优化

林劲草，肖 莉，吴酬飞，张绍勇，杨惠宁，张立钦,

（1. 浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300；2. 湖州师范学院 生命科学学院，浙江 湖州313000；3. 湖州师范学院 浙江省媒介生物学与病原控制重点实验室，浙江 湖州 313000）

喜树碱(camptothecin, CPT)是一种细胞毒性喹啉类生物碱，1966年由WALL等[1]首次从喜树Camptotheca acuminata中分离得到。作为植物源农药的喜树碱是一种昆虫不育剂[2]，并且对昆虫有触杀和胃毒的作用[3]；对黄瓜白粉病Sphaerotheca fuliginea、番茄灰霉病Botrytis cinerea等也有较好的防治效果[4]。因此，喜树碱在农业病虫害防治方面有较大的应用开发潜力。马比木Nothapodytes pittosporoides是茶茱萸科Icacinaceae假柴龙树属Nothapodytes灌木，又名海桐马比木、公黄珠子、追风伞[5]。主产于贵州、湖南、湖北、四川等地，入药能除湿、祛风、理气，主治湿痹、浮肿、疝气[6−7]。在马比木植株中，其根、茎、枝、叶、果实和种子中都含有喜树碱[8−10]。随着市场对喜树碱需求量不断增加，马比木作为喜树碱药源, 具有原料成本低的优点，是国家二级保护植物喜树的最佳替代品，已成为提取喜树碱的重要原料[11−13]。目前国内关于马比木中喜树碱提取工艺的研究较少，且基本采用的均为正交设计优化。本研究以马比木为原料，以喜树碱提取率作为优化指标，采用Box-Behnken响应面法对喜树碱的提取工艺进行了研究，以期为喜树碱提取工艺的优化提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器 高效液相色谱仪 (型号 1260，Agilent)；高速多功能粉碎机 (800Y-304，旭曼)；超声波清洗器(DS-080S，工作频率40 kHz，东森)；电子分析天平(ME204E，METTLER TLLEDO)。

1.1.2 实验材料 马比木 (购于贵州中药材市场, 主要为枝和叶)，晒干后粉碎过 60 目筛。

1.1.3 实验试剂 甲醇 (上海阿拉丁生化科技股份有限公司，分析纯)；甲醇 (北京百灵威科技有限公司，色谱纯)；乙腈(北京百灵威科技有限公司，色谱纯)；水为超纯水；喜树碱对照样品(纯度≥98%，合肥博美有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 对照样品溶液制备 称取喜树碱标准样品 10.50 mg，置于容量瓶中，甲醇溶解稀释、定容至50 mL，配制质量浓度为0.21 g·L−1的喜树碱对照样品溶液，摇匀，备用。

1.2.2 样品溶液制备 称取粉碎后马比木粉末 5.06 g，置于锥形瓶中，加入甲醇 100 mL，室温下超声30 min，0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

1.2.3 色谱条件 色谱柱 Alltima C18(4.6 mm×250.0 mm，5 μm)；流动相为乙腈∶水=25∶75(V∶V)；流速1.0 mL·min−1；检测波长 254 nm；柱温 30 ℃；进样量 20 μL。

1.2.4 标准曲线绘制 取对照样品溶液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL 置于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容至10 mL，按照1.2.3色谱条件进行检测。以喜树碱质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 马比木中喜树碱提取率测定 称取粉碎后的马比木粉末 10.16 g，置于锥形瓶中，加入甲醇 100 mL，温度条件30 ℃，超声30 min，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液按照1.2.3色谱条件进行检测。根据以下公式计算喜树碱提取率(R1)：R1=CV/1 000M×100%。其中：C表示提取液中喜树碱质量浓度(g·L−1)，V表示溶剂体积(mL)，M表示药材质量(g)。

1.2.6 单因素试验设计 称取粉碎后马比木粉末10 g，置于锥形瓶中，将3个实验因素：甲醇体积分数、超声时间、液料比中2个固定不变，1个作为变量进行单因素试验，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液在1.2.3色谱条件进行检测，平行3次，取平均值。

1.2.7 Box-Behnken 设计优化提取条件 在单因素实验基础上，选择超声时间 30 min、甲醇体积分数80% 和 液 料 比 20 mL·g−1(溶 剂 体 积 ∶药 材 质量=100∶5)3个因素进行优化实验。以喜树碱提取率为指标，采用Box-Behnken设计优化提取条件。因素水平如表1所示。

1.2.8 数据 处理及 分析 响应 面实验 数 据采用Designer-Expert 8.0软件进行处理，并对数据进行差异显著性分析。

表 1 因素水平表Table 1 Factors and levels

2 结果与讨论

2.1 标准曲线绘制

为准确测量马比木中喜树碱的质量浓度，建立高效液相色谱法，以喜树碱质量浓度为横坐标(x)，峰面积为纵坐标(y)，计算得线性回归方程为：y=9×106x+902 381，相关系数R2=0.999 2，喜树碱质量浓度的线性范围为 0.021～0.189 g·L−1。

2.2 单因素实验结果果

2.2.1 甲醇体积分数对喜树碱提取率的影响 在超声时间为 30 min，液料比为 20 mL·g−1时，选取甲醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%的条件下进行提取。由图1A可知：随着甲醇体积分数的增大，喜树碱的提取率先增大后减小。当甲醇体积分数超过80%时，提取率开始减小。提高甲醇体积分数有利于喜树碱的提取，当甲醇体积分数＞80%时，喜树碱提取率反而降低，可能由于随甲醇体积分数的提高，提取液极性减小，其中某些杂质的溶出增加，干扰了马比木的检测，提取率下降。当甲醇体积分数为80%时，提取率达最大值，因此选择甲醇体积分数为80%为宜。

2.2.2 超声时间对喜树碱提取率的影响 在甲醇体积分数为 80%，液料比为 20 mL·g−1时，选取超声时间分别为10、20、30、40和50 min的条件下进行提取。由图1B可知：随超声时间的增加，喜树碱提取率先增加后减小，在超声时间为30 min时喜树碱提取率最高。这是因为随超声时间增加，喜树碱发生氧化的概率也会增大，使提取率降低，所以选择提取时间为30 min适宜。

2.2.3 液料比对喜碱提取率的影响 在超声时间为30 min，甲醇体积分数为 80% 时，选取液料比分别为12、16、20、24和28 mL·g−1的条件进行提取。由图1C可知：随着液料比由小到大，喜树碱提取率先增加后减小，提取率最高的液料比为20 mL·g−1。随着溶剂的增多，马比木与溶剂之间能充分接触，有利于马比木溶解于溶剂中，当液料比超过20 mL·g−1后，已经达到饱和状态，再加就稀释了，喜树碱提取率下降，所以选择液料比20 mL·g−1较适宜。

图 1 不同影响因素下喜树碱提取率的变化Figure 1 Change of the extraction rate of camptothecin under different influencing factors

2.3 响应面优化实验结果

依据单因素实验结果，初步选定甲醇体积分数80%、超声时间30 min和液料比20 mL·g−1为最佳提取条件，采用Box-Behnken响应面法对其进行优化，结果如表2所示。

以喜树碱提取率为指标(R1)，采用Designer-Expert 8.0软件进行二次多项式回归拟合，得到方程：R1=0.11−8.500×10−3A+6.125×10−3B+4.375×10−3C+7.000×10−3AB−0.014AC+0.015BC−0.026A2−0.024B2−0.030C2。其中：A表示甲醇体积分数，B表示超声时间，C表示液料比。多元回归模型的方差分析见表3。由ANVOA分析可知：在考察指标的二项式方程中，模型的F为24.59(P=0.000 2＜0.001)，说明回归模型极显著；拟合相关系数R2=0.969 3，调整系数R2Adj=0.929 9，失拟项显著(P=0.034 3＜0.05)。该模型拟合程度较好，实验误差较小；信噪比较高，为12.503＞4.000，说明该多元回归模型可预测马比木中喜树碱的最优提取工艺条件。

显著性检验结果表明：甲醇体积分数(A)、超声时间(B)、液料比(C)对马比木中喜树碱提取率的影响顺序依次为A、B、C。甲醇体积分数的二次项A2、超声时间的二次项B2、液料比的二次项C2对马比木中喜树碱的提取率有极显著影响(P＜0.001)；超声时间和液料比的交互项BC对马比木中喜树碱的提取率有极显著影响(P＜0.01)；甲醇体积分数A与甲醇体积分数和液料比的交互项AC对马比木中喜树碱的提取率有显著影响(P＜0.05)；超声时间B、液料比C、甲醇体积分数与超声时间的交互项AB对马比木中喜树碱提取率的影响不显著(P＞0.05)。

表 2 Box-Behnken 设计实验和结果Table 2 Box-Behnken Design tests and results

表 3 响应面回归模型 ANOVA 分析结果Table 3 Response surface regression model ANOVA analysis results

相对于3个单因素的其中2个因素，采用Box-Behnken绘制三维响应面图，两两因素的交互作用对马比木中喜树碱提取率的影响见图2。由图2A可见：甲醇体积分数A的曲面较陡峭，超声时间B的曲面较平缓，说明甲醇体积分数对马比木中喜树碱提取率的影响比超声时间的影响大。由图2B可见：甲醇体积分数A的曲面较为陡峭，液料比C的曲面较为平缓，说明甲醇体积分数对马比木中喜树碱提取率的影响比液料比大。由图2C可见：超声时间B的曲面较陡，液料比C的曲面较为平缓，表明超声时间对马比木中喜树碱提取率的影响比液料比的影响大。可见，在选择的3个单因素中，甲醇体积分数A对马比木中喜树碱的提取率的影响显著，表现为其曲线较陡；在两两因素交互作用中，甲醇体积分数与液料比的交互作用(AC)对马比木中喜树碱的提取率影响显著，超声时间与液料比的交互作用(BC)对马比木中喜树碱的提取率影响显著。

2.4 最优方案验证

根据模型预测，得到马比木中喜树碱提取的最优工艺为：甲醇体积分数46.4%，超声时间26.1 min，液料比21.20 mL·g−1。在此条件下进行3次平行实验，测得喜树碱提取率分别为0.080 4%、0.082 6%、0.082 1%，与模型预测值接近，平均误差3.2%，表明模型能较好地预测喜树碱实际提取率。

图 2 不同影响因素对喜树碱提取率影响的响应面图Figure 2 Response surface diagram of the effect of different influencing factors on camptothecin extraction rate

3 结论

本研究以马比木为原料，以喜树碱提取率作为优化指标，在单因素实验基础上，选取甲醇体积分数、超声时间和液料比3个因素，通过Box-Behnken响应面法对17组实验进行分析，在整个区域得到回归方程，可以直观反映出各个因素对喜树碱提取率的影响。优化的最优工艺为：甲醇体积分数46.4%，超声时间 26.1 min，液料比 21.20 mL·g−1，喜树碱提取率为 0.084 4%。3 次验证实验结果显示：提取率平均误差3.2%。说明本次建立的拟合模型较为成功，可以为马比木中喜树碱的提取应用提供一定的参考。