海水中汞样品保存方法研究

陈卫卫 ，赵 恒 ，杨 颖 ，2*，杨幸幸

（1. 国家海洋局东海环境监测中心， 上海 201206；2. 自然资源部海洋生态监测与修复技术重点实验室， 上海201206）

汞是毒性最强的重金属污染物之一，已被我国和联合国环境规划署、世界卫生组织、欧盟及美国环境保护署等机构列为优先控制污染物[1]。我国汞污染环境问题较为突出，大规模的工、矿业活动，如汞冶炼、铅锌冶炼、混汞采金和氯碱生产等导致的局地汞污染问题非常严峻。排放到环境中的汞随着河流、直排口、大气沉降等方式进入海洋，最终影响海洋生态环境和食物链，因此海水中汞是监测海洋环境污染状况的重要指标之一。一般情况下，汞在海水中的含量极低，属于痕量元素，且稳定性差，从20 世纪70 年代以来，国内外关于水体中汞的样品采集、保存和检测方法的研究较多[2-8]。陆贤崑等[2]试验了Pyrex 玻璃瓶、聚乙烯瓶、聚四氟乙烯瓶等容器，并加入不同固定剂保存ng/L 级汞的天然海水样品，发现玻璃瓶和聚四氟乙烯瓶适合较长期保存汞样品，聚乙烯瓶则对汞样品有较明显的沾污。罗伟权等[3]选择了硝酸钾、重铬酸钾和过硫酸钾作固体保存剂，进行了海水中汞样保存的对比实验，发现0.1%（w/v）过硫酸钾作保存剂效果较好，可保存3 个月；硝酸钾不宜用作海水中汞的保存剂。潜琬英等[4]试验了六种不同固定剂对近岸海水样品和放置澄清的测汞海水样品对汞的保护作用，发现所试验的几种试剂对未过滤的近岸海水样品均没有明显的稳定作用。《海洋监测规范》（GB 17378.4-2007）[9]中要求用玻璃瓶盛装海水中汞样品，样品不过滤，现场加浓硫酸至pH＜2，再加入一定量的5%（w/v）过硫酸钾溶液，可以保存13 天。

根据前人的研究结果和标准方法，针对海水中汞监测中存在的问题，本文开展了三方面技术验证。一是不同玻璃器皿对汞的吸附特性是否一致，选择了常用的100 mL 普通磨口广口玻璃瓶（简称“玻璃瓶”或“瓶”），与100 mL 细长棕色螺口硬质玻璃样品管（简称“玻璃管”或“管”）进行试验；二是验证汞样品检测中用到的过硫酸钾氧化剂在采样现场添加及在试验室检测前添加的不同影响；三是验证样品保存时效。

1 材料与方法

1.1 方法与仪器

本试验采用的分析方法为《海洋监测规范》（GB 17378.4-2007）中原子荧光法[9]，采用 PF6-2 型非色散原子荧光光度计（检出限＜1 ng/L）。试验用的玻璃瓶和玻璃管在使用前用相同的盐酸溶液浸泡24 h 以上。

1.2 试验方案

根据试验目的设计了试验方案，共设置5 项变量，分别为试验容器（玻璃瓶和玻璃管）、空白检验、水样基质影响（蒸馏水和海水，其中海水基体采用陈化后的远洋海水，并经空白检验合格）、加入过硫酸钾氧化剂时间以及样品保存时间，评价各变量对测定结果的影响程度。从样品配制完成开始，分别测定了 1 d、2 d、7 d、14 d、20 d、27 d 共 6 批次样品。试验样品按如下方法制备：

（1） 分别移取 5.00 μg/L 样品制备标准溶液4.00 mL 和 8.00 mL 于 500 mL 容量瓶，分别用蒸馏水、远洋海水定容，配制成浓度为40.0 ng/L 和80.0 ng/L 加标样。

（2）分别将两种浓度的加标样保存于玻璃瓶、玻璃管中，每个浓度包含3 个平行样，每批次共有36个标样，按时间顺序共6 批次，样品设置情况见表1。

（3）空白样，使用蒸馏水和远洋海水作空白。蒸馏水空白样品设置3 份，2 份保存于玻璃瓶，1 份于玻璃管中，其中保存于玻璃瓶的1 份空白用于提前加入氧化剂试验，每次测定3 个空白平行样；空白样品设置情况见表2。

表1 加标样品设置类型说明

表2 空白样品设置类型说明

1.3 样品预处理

（1）所有样品均加入1 mL 浓硫酸固定；

（2）其中一份远海海水加标样，在加入硫酸固定剂后，立即加入2.5 mL 氧化剂，制成“海水+氧化剂”样品。同时取用玻璃瓶配制12 个空白样，在加入硫酸固定剂后，立即加入2.5 mL 氧化剂，制成“空白+氧化剂”样品；

（3）除空白+氧化剂、海水+氧化剂（瓶）、海水+氧化剂（管）样品外，其余样品均在测量前一天加入过硫酸钾氧化剂。

1.4 评估方法

1.4.1 准确度和精密度 准确度根据《海洋监测规范》（GB 17378.2-2007）[10]中两组数据差异性检验中的成对数据t 检验法对测定结果的回收率差异进行统计，以评价不同试验条件测定数据的准确度。控制单一变量，将测定数据分为两组进行成对数据t检验，当 t＜tɑ（0.05），差异不显著，当 tɑ（0.05）＜t＜tɑ（0.01），差异较显著，当 t＞tɑ（0.01），差异很显著。成对数据 t 检验计算公式如式（1）。精密度根据《海洋监测规范》（GB 17378.2-2007）[10]中两组数据差异性检验中的F 检验法对测定结果的回收率方差的齐性进行检验，计算公式如式（2），以评价不同试验条件测得数据的精密度。

1.4.2 趋势分析 统计样品测定时间与试验回收率的Pearson 相关系数，分析测定时间与回收率的线性相关性，判断样品在冷藏条件下长时间保存对测定数据准确性的影响。将不同试验条件的6 批次数据与样品测定时间做相关性分析，第一批次试验时间计1 天，后续5 批次试验时间分别为2、7、14、20 和 27 天。依据 Pearson 相关系数（r）及显著性水平（P）判断相关性。Pearson 相关系数（r）的计算公式如式（3），P 值是配对t 检验计算过程中得到的结果，用来评估相关程度计算结果的“显著程度”。

P 值的计算是建立在如下两个假设基础上的：（1）无效假设 H0：两参量间不存在“线性”关联；（2）备择假设H1：两参量间存在“线性”关联。若P＞0.05，则不能拒绝无效假设H0，说明测定时间与回收率线性相关性不显著；若0.01＜P＜0.05，则测定时间与回收率线性相关性较显著；若P＜0.01，则相信备择假设H1，测定时间与回收率线性相关性很显著；当r＞0，测定时间与回收率呈正相关，当r＜0，测定时间与回收率呈负相关，|r|越接近1，相关性越强。

2 结果与分析

2.1 试验结果

根据试验方案对设计的12 类样品及内控样、空白样等进行测试，表3 汇总了本试验中不同控制变量样品及空白样品的测定数据的平均值。表中容器列为“瓶”的意为以玻璃样品瓶为容器，为“管”的意为以玻璃样品管为容器。

表3 各类样品平行测试结果平均值统计表

2.2 异常值判断与剔除

采用《海洋监测规范》[10]中Grubbs 检验法和加标样品回收率容许限值对测定结果中的异常数据进行判定。异常值剔除分为两个步骤：

（1）采用Grubbs 检验法对同一方法的不同时间批次得到的18 个测量值进行一致性检验，根据检验结果，判断3 个数据为异常值，不计入平均值的计算，分别为第4 批次玻璃瓶空白1 个，第3 批次玻璃管装蒸馏水样品（80 ng/L）1 个，第2 批次玻璃瓶装海水样品（80 ng/L）1 个。

（2）根据平行样品测定值计算加标样品的平均回收率，根据《近岸海域环境监测规范》（HJ442-2008），回收率容许值定为60%～120%，剔除不满足回收率要求的12 个测量值，分别是玻璃瓶装海水基质立即加氧化剂样品（40 ng/L）第 3、4、5、6 批次共8 个数据，玻璃瓶装海水基质立即加氧化剂样品（80 ng/L）第4 和第6 批次共4 个数据，使平均回收率处于允许值范围内。

2.3 数据归一化

与通常回收率计算方法不同，为了对比六次测定批次间的变化情况，需使用内控结果对样品测量值进行归一化修正，即消除仪器响应的波动对测定结果的影响。平均回收率的计算公式如式（4）。

式中：ci为样品汞的测量值，单位为 ng/L；csb为样品对应容器的样本空白测量值，单位为ng/L；crb为试剂空白测量值，单位为ng/L；cs为加入标准浓度，单位为ng/L。样品取样量为50 mL，在加1 mL硫酸和2.5 mL 氧化剂后，浓度会略有降低，加标浓度为40 ng/L 的样品实际浓度约为37.4 ng/L，80 ng/L的样品实际浓度约为74.8 ng/L。

剔除异常数据后，计算得到各组平行样的平均回收率，如表4 所示。

表4 平行样品平均回收率汇总

2.4 试验变量影响分析

利用SPSS 统计分析软件的成对t 检验及F 检验的方法对不同试验变量的数据进行差异性检验，结果见表5。检验结果显示：

（1）当试验变量为试验容器时，以海水样品统计，t＞tɑ(0.01)且 P＜0.01，表明使用不同容器得到测量数据的准确度差异显著，使用玻璃瓶进行的试验回收率平均值为95.8%，高于使用玻璃管的回收率平均值约4 个百分点，可能是因为比表面积更大的玻璃管对汞吸附能力更强；Fɑ(0.05)＜F＜Fɑ(0.01)且 0.01＜P＜0.05，表明两种条件的数据精密度差异较显著，回收率标准偏差分析结果表明，玻璃管的回收率标准偏差略低于玻璃瓶，使用玻璃管的回收率波动更小。此外，数据处理过程中剔除的15 个异常值中，使用玻璃瓶的为13 个，使用玻璃管的仅为2 个，表明使用玻璃瓶进行试验更易受到干扰，而玻璃管的密封性更好，使用玻璃管的试验数据精密度较高、稳定性更强。

（2）当试验变量为初始加标浓度时，t＜tɑ(0.05)且P＞0.05，表明不同初始加标浓度得到的回收率数据差异性不显著，40 ng/L 和80 ng/L 的初始制备液进行试验得到平均回收率分别为91.0%和91.3%，两者较接近，认为准确度相同；Fɑ(0.05)＜F＜Fɑ(0.01)且 0.01＜P＜0.05，表明两种初始加标浓度测得的数据精密度差异较显著，初始加标浓度为40 ng/L 的回收率标准偏差要稍高于初始加标浓度为80 ng/L 的回收率。

（3）当试验变量为不同基质时，t＞tɑ(0.01)且 P＜＜0.01，表明蒸馏水和海水作为不同基质得到的回收率数据差异性很显著，海水基质的回收率平均值为91.9%，而蒸馏水基质的回收率平均值为84.5%，海水作为基质时的回收率明显高于淡水基质，准确度较高。吴宏海等[11]研究表明，随着离子强度增加，石英对Cu2+离子的吸附量逐渐减少，这是因为溶液中Na+离子与Cu2+离子竞争石英表面的带负电的吸附位点，海水基质中的Na+离子强度明显高于蒸馏水，因而溶液中Na+离子与玻璃容器表面吸附位点的结合能力更强，导致容器对Hg2+离子吸附减弱，进而使海水基质样品的回收率升高；F＜Fɑ(0.05)且 P＞0.05，表明两种基质测得的数据精密度差异不显著。

（4）当试验变量为是在加入硫酸固定剂后，马上加入2.5 mL 氧化剂时，由于瓶装样品中共有11个样品结果为异常值，此处采用管装海水样品进行统计，t＜tɑ(0.05)且 P＞0.05，表明是否立即加入氧化剂得到的回收率数据差异性不显著，没有立即加入氧化剂的回收率平均值为89.9%，而立即加入氧化剂的回收率平均值为91.9%，两者较为接近，认为准确度相同；F＜Fɑ(0.05)且 P＞0.05，表明是否立即加入氧化剂测得的数据精密度差异不显著。但是，值得注意的是，剔除的15 个异常值中，有12 个数据来自立即加入氧化剂的样品，原因可能是立即加入氧化剂的试验操作更容易对样品造成玷污。

表5 回收率准确度及精密度检验结果

表6 检测结果与时间序列的相关性分析

2.5 回收率变化趋势分析

6 批次样品测定共持续27d，将试验时间与试验回收率结果做线性相关性分析，以判断样品在长时间保存情况下，测定数据的准确性是否会受到影响。相关性分析结果如表6 所示。结果显示，本试验涉及的12 种变量组合条件下，分析时间与回收率之间均无显著相关性；图1 为不同测定时间的回收率变化情况，第2 天回收率结果整体偏低应为测定方法的系统误差，可以通过仪器和试剂的校准予以修正。因此，可以认为不同初始条件的汞样品在本试验的保存条件下可长时间维持测定数据的准确性。

3 结论

本文试验结果表明，不同保存容器和预处理方法会对不同基质的水质汞样品的回收率产生影响，具体结论如下：

（1）对样品测定准确度影响较大的因素为保存容器，磨口广口玻璃瓶盛装水样的回收率更高，平均回收率为93.8%，高于使用细长棕色硬质玻璃管89.9%的平均回收率；但是精密度检验结果及异常数据分析表明使用玻璃瓶测定的数据稳定性较差，更易受到玷污。

（2）不同样品基质也是影响回收率的重要因素。海水样品的平均回收率为93.4%，高于蒸馏水基质的84.2%。本文试验采用了纯海水基质，但在河口区监测时，盐度变化大，情况更复杂，还需要进一步验证。

图1 不同保存时间的回收率变化情况

（3）不同初始加标浓度及是否在加入固定剂后立即加入氧化剂这两个因素对回收率没有影响，但较低浓度样品检测稳定性降低，更易受其他因素影响。对于玻璃瓶采样，立即加入氧化剂的操作可能是异常情况增加的原因之一。

（4）样品长时间保存后的测定结果显示，汞的回收率不会受保存时间的影响，至少在27 天内可维持测定数据的准确性。

综上，在实际水样监测过程中，可优先选用广口磨口玻璃瓶作为样品保存容器，但要注意容器的密封性，做好样品的防玷污措施；选择硬质螺口玻璃管时，需确认容器吸附性是否达到平衡。如果样品需保存一段时间后测定，不必在加入固定剂后立即加入氧化剂。经预处理后的样品可保存约1 个月。