组胺对新生大鼠离体脊髓运动神经元下行激活的影响

汪 燕，黄媛媛，汪萌芽

(皖南医学院 细胞电生理研究室，安徽 芜湖 241002)

组胺是一种由组氨酸合成的生物活性胺化合物，不仅存在于肥大细胞、嗜碱性粒细胞等非神经元细胞，也作为神经递质存在于神经元中[1]。中枢组胺能神经元起源于下丘脑的结节乳头状核(TMN)内，向广泛区域发出投射，尤其是大脑皮质、杏仁核、基底节区、海马、丘脑和脊髓等[2-3]。组胺能系统参与了睡眠-觉醒周期、能量和内分泌稳态等机体多种生理功能的调节，并参与突触可塑性以及学习记忆和运动控制等[3-6]。组胺存在4种受体亚型，即H1～H4受体，又以H1～H3在中枢神经系统中明显表达。不同之处在于，中枢组胺的H1和H2受体为突触后受体，而组胺H3受体为突触前自身异种受体[3,5]。

组胺一直被认为是全脑活动的调节剂。小脑[7]、基底节区[8]、前庭核[9]和红核[10]等多个大脑皮层下有大量组胺受体分布，它们通过轴突曲张体释放，再经促代谢型受体发挥作用。早在20世纪80年代末到90年代初，一系列的神经解剖学研究就报道了下丘脑-脊髓组胺能直接投射到哺乳动物脊髓的背角和腹角。免疫染色和示踪研究也证明了从下丘脑后部到脊髓腹侧有直接的组胺能投射[11-12]。从大鼠胚胎第14天起，脊髓腹角运动神经元在颈、胸和腰髓段就表现出组胺免疫反应活性[12]。尽管组胺对脊髓感觉神经元和痛觉的作用受到了广泛的关注[13-16]，对脊髓MN的激活作用也有涉及[17],但罕见关于组胺对脊髓运动神经元(motoneuron，MN)下行激活的影响的报道。本文主要通过脊髓切片的制备和细胞内记录方法，观察组胺对离体脊髓同侧腹外侧索(ipsilateral ventrolateral funiculus,iVLF)电刺激诱发的MN兴奋性突触后电位(excitatory postsynaptic potential,EPSP)的影响，以明确组胺对脊髓下行激活调控运动输出的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与脊髓切片制备 按本实验室报道方法[18]，新生SD大鼠(8～14日龄)购自南京江宁青龙山动物繁殖场[许可证号 SCXK(苏)2017-0001]。经乙醚麻醉后，分离出腰骶膨大处脊髓段，用振荡切片机(Vibratome 1500,Technical Products International Inc.,USA)制备400～500 μm脊髓横切片4～6片，室温下置于含95%O2和5%CO2混合气体饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)中备用。从脊髓游离到切片制备完成需控制在15 min以内。ACSF配方(mmol/L)：CaCl22.4,NaCl 127.0,KCl 1.9,KH2PO41.2,MgSO4·7H2O 1.3,Glucose·H2O 10.0,NaHCO326.0。

1.2 细胞内纪录 脊髓切片于室温下孵育40～60 min后，用胶头滴管吸取置于自制的全浸式记录浴槽内，用上、下两个丝网相夹固定，经恒流泵(HL-2,上海精科实业有限公司)持续灌流用混合气体饱和的ACSF,灌流液的温度应控制在(28±3)℃。取充填3mol/L乙酸钾，尖端阻抗为60～160 ΜΩ用含纤维微电极毛坯(FSG12，Dagan Co.,USA)拉制的微电极，在双目立体显微镜(北京泰克仪器有限公司)下对脊髓腹角MN区进行细胞穿刺。将一根同芯双极刺激电极(Frederick Haer & Co.,USA)置于同侧腹根用于电刺激进行逆行激活鉴定，另一根刺激电极置于iVLF施加测试刺激(单脉冲，波宽0.1～0.3 ms，10次/分钟，10～100 V)以诱发突触反应。记录到的电信号经Axoclamp 900A微电极放大器(Axon Instrument,Inc.,USA)处理后，通过Digidata 1440A转换接口(Axon Instrument,Inc.,USA)输入计算机，用Clampex 10.2软件(Axon Instrument,Inc.,USA)采样、记录和贮存。

1.3 药物 组胺(C5H9N3,Sigma,USA),用去离子纯水配成10 mmol/L的母液，在-20℃冰箱中冷冻备用，使用前用标准ACSF将母液稀释到所需浓度灌流给药。

2 结果

2.1 MN及其iVLF-EPSP的基本电生理参数 在常规电流钳模式下，选用静息电位(resting potential,RP)负于-60 mV，且动作电位(action potential,AP)有超射的，能稳定记录15 min以上的状态良好的细胞，进行逆行激活鉴定，若记录到“全或无”特性的逆行 AP或碰撞试验呈阳性，即可鉴定为MN，继续用于实验。在54个稳定记录的MN，检测其RP为(-64.71±4.23)mV，AP幅值为(75.68±7.44)mV、超射值为(11.77±5.65)mV(表1)。以同芯双极电极刺激 iVLF，阈强度刺激在54个MN记录到iVLF-EPSP，其幅值为(4.60±2.88)mV，时程为(52.87±29.32)ms，曲线下面积为(98.77±90.03)mV·ms(表2)。

表1 离体MN基本电生理参数

表2 离体MN阈刺激诱发iVLF-EPSPs的电生理参数

2.2 组胺对脊髓MN电学性质的影响 对14个MN给予100 μmol/L组胺灌流3～6 min，在11个细胞观察到膜去极化反应(P<0.01，表3)，并伴随膜电阻增大的趋势。同时组胺还能延长峰电位的半幅时程、上升时间、下降时间(P<0.01)，降低峰电位的上升和下降斜率(P<0.01)。MN在组胺灌流后，AP的发放频率明显增加(图1)。在低Ca2+/高Mg2+ACSF(Ca2+0.24 mmol/L，Mg2+13.0 mmol/L)条件下，组胺在同一MN诱发的去极化反应无明显改变(图2)。

该MN的RP为-70 mV，Control：用药前记录的RP和AP，Histamine：灌流组胺(100 μmol/L)5 min后记录到同一MN的AP，Low Ca2+/High Mg2+：灌流低Ca2+/高Mg2+ACSF配置的组胺(100 μmol/L)后该MN的膜电位和AP，Wash：标准ACSF冲洗5 min后该MN的AP。

表3 组胺(100 μmol/L)对离体MN膜电学性质的影响

以一个RP为-75 mV的MN为例。Control：初始的AP；Histamine：分别灌流组胺(100 μmol/L)3、6 min后所记录到的同一MN的AP；Wash：ACSF冲洗5 min后该MN的AP。

2.3 组胺增加MN自发放电 上述发生去极化的11个MN中，有5个MN除了出现如图1的放电频率增加，同时还增加自发放电。我们记录到的初始AP幅度为(69.57±4.80)mV，放电频率为(1.40±1.14)Hz；持续灌流组胺(100 μmol/L，2 mL/min)10 min后,AP幅度为(60.89±5.75)mV(P<0.05)，放电频率增加至(15.60±6.19)Hz(P<0.01)，更换ACSF冲洗5 min后,自发放电频率可恢复(图3)。

Control：一个RP为-75 mV的典型MN的自发放电；Histamin：组胺(100 μmol/L)灌流5 min后，同一MN的自发放电；Wash：ACSF冲洗5 min后该MN的自发放电。

2.4 组胺对iVLF-EPSP的影响 在11个记录到iVLF-EPSP的MN，灌流组胺(100 μmol/L)3～6 min，典型记录见图4A，测得的参数分析结果见图4B～D，表明组胺(100 μmol/L)能增加iVLF-EPSP的幅度(P<0.05),增大曲线下面积(P<0.05)，延长时程(P<0.05)，且作用具有可逆性。

A：典型记录图显示组胺(100 μmol/L)对脊髓MN的iVLF-EPSP有增大作用；B～D：组胺对MN的iVLF-EPSP幅度、曲线下面积及时程影响的统计图。配对t检验：*P<0.05。

3 讨论

脊髓MN的活动依赖多通路调控，其中脑干发出的下行通路能直接或间接地(通过中间神经元)影响脊髓 MN运动控制的输出[19]。既往的离体MN的研究中，常常采用电刺激腹外侧索激活下行纤维的方法，诱发MN的兴奋性突触后反应。汪萌芽等的研究显示，腹外侧索诱导的EPSP主要由non-NMDA型兴奋性氨基酸受体介导，是以Na+、K+通透性增加为主的复合型离子机制[20]。本实验运用此技术，观察到组胺引起新生大鼠脊髓切片MN发生去极化反应，且该作用不受低Ca2+/高Mg2+ACSF(Ca2+0.24 mmol/L，Mg2+13.0 mmol/L)灌流的影响；组胺灌流离体MN后引起iVLF-EPSP幅度升高、曲线下面积增大、半幅时程延长(P<0.05)，该反应具有可逆性；灌流100μmol/L组胺可呈现出明显的时间依赖性增强，表现为iVLF-EPSP的幅度、自发放电频率均增加。翟祥薇与Liu等曾报道组胺通过激活与H1受体偶联的Na+-Ca2+交换器和与H2受体耦联的超极化激活环核苷酸门控阳离子通道，共同介导了组胺能对这两类中间投射神经元的去极化作用[21-22]，故我们推测组胺通过突触后H1和H2受体间接引起MN的去极化反应来促进突触传递，通过增强大鼠脊髓下行激活来调节运动控制的输出。这一点与Wu等人关于组胺通过激活组胺H1和H2受体增强MN的兴奋性的报道一致[17]。而组胺灌流后自发放电增多以及其对I-V曲线的影响中，可见组胺不但能诱导MN兴奋，也能导致MN兴奋性增高，推测组胺可增强MN对大脑皮层及脑干下传的运动指令输入的反应。另外，在Wu等人的研究中提到[17]，组胺对膜电阻的影响有显著增加和降低两种形式，我们的实验中发现，组胺对膜电阻的作用是一个先降低后增加的过程，这可能与组胺的作用是受多重受体介导有关，起初的膜电阻降低可能是与组胺H2受体结合的Ih通道激活和/或抑制钙激活钾通道导致，后期的膜电阻增高则考虑与H1受体结合的钾离子通道被阻断，钙激活的阳离子通道和/或Na+-Ca2+交换器被激活密切相关[22-24]。

组胺诱导的MN兴奋和兴奋性增加，可增强MN对大脑皮层和脑干的运动指令以及脊髓局部回路的感觉及其它输入反应。因此，通过兴奋MN，下丘脑-脊髓组胺能神经可能直接调节最终的运动输出，并积极而持续地调节脊髓的运动执行和运动反射。越来越多的证据表明，脊髓损伤甚或脑卒中所导致的运动单位放电模式的改变可能是调节系统和兴奋性控制系统的中断造成的，这对脊髓侧索硬化症等运动神经元退变病亦非常重要[25]。因此，神经调节系统，包括中枢组胺能系统，有可能为治疗脊髓运动障碍提供新的、高效的治疗策略。另一方面，由于下丘脑是脊髓MN组胺能神经支配的来源，是非躯体(内脏)功能的高级调控中心，可以推测下丘脑组织胺能投射对MN的直接兴奋性调节可能有助于机体产生适当的躯体运动反射，以适应非躯体活动的变化。这种躯体-非躯体的整合可能在动物面临来自内外环境的挑战时，在产生协调的行为反应方面发挥关键作用[26]。