甲状腺癌中LZTS2蛋白表达及与BRAFV600E基因突变的关系

张亚丽，李丝冰，王 艺，张 贺，张其栋，夏庆欣

甲状腺癌(thyroid carcinoma, TC)发病率在全球呈逐年上升趋势[1]。Haugen等[2]报道TC发病率虽然较高，但患者临床预后普遍较好。影响TC患者预后的因素很多，如转移(淋巴结或远隔脏器)、基因突变及缺氧诱导微环境等[3]。亮氨酸拉链肿瘤抑制因子2(leucine zipper tumor suppressor 2, LZTS2)基因是近年新发现的抑癌基因[4]，其为肿瘤的治疗提供新的方向。已有研究表明LZTS2在正常前列腺、卵巢组织中高表达，且与多种肿瘤包括鼻咽癌、肺癌、胃癌、乳腺癌及神经胶质瘤等肿瘤发生、发展及患者预后具有相关性[5-8]。但有关LZTS2在TC中的表达及生物学作用尚未见相关报道。BRAF基因突变见于多种疾病，在TC中(尤其甲状腺乳头状癌)以BRAFV600E基因突变发生率最高[9]，BRAFV600E基因突变与影响TC患者预后的因素如淋巴结转移、包膜侵犯及TNM分期等有相关性。有研究表明[10]，LZTS2/LAPSER1基因与相关基因或蛋白在肿瘤的发生、发展过程中存在协同或抑制作用。本组通过免疫组化法检测TC组织中LZTS2蛋白表达，并通过荧光PCR法检测BRAFV600E基因突变情况，探讨两者相关性，着重分析LZTS2蛋白表达与TC临床病理特征的关系，以期为TC患者的不良预后提供更多合理的生物标志物，进而为临床个体化治疗提供可靠的依据。

1 材料与方法

1.1 临床资料选取郑州大学附属肿瘤医院病理科2016年1月～2019年10月经病理确诊的140例TC(包括48例甲状腺乳头状癌、41例甲状腺滤泡癌、23例未分化癌、28例髓样癌)肿瘤组织作为实验组，其中67例TC患者术前行超声引导下甲状腺结节细针穿刺新鲜组织BRAFV600E基因突变检测，并选取82例结节性甲状腺肿组织作为对照组。回顾性分析实验组TC患者的临床病理资料。肿瘤TNM分期标准采用美国癌症联合会(American joint committee on cancer, AJCC)第8版标准。纳入标准：(1)切片由两位高级职称病理医师诊断；(2)患者在本次治疗前未接受放、化疗；(3)临床与病理资料完善；(4)心、肝肾功能正常。排除标准：(1)合并其他类型恶性肿瘤；(2)临床病理资料不齐全；(3)合并精神障碍者。

1.2 主要试剂兔抗人LZTS2单克隆抗体(ATLAS，克隆号R41398，稀释浓度1 ∶100)；人类BRAF基因突变检测试剂盒(北京雅康博生物公司)；DAB显色试剂盒、SP试剂盒(美国Ventana公司)等。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 标本经10%中性福尔马林固定、脱水、包埋、切片和HE染色。免疫组化采用Ventana Benchmark XT自动免疫组化仪染色。显微镜(OLYMPUS BX41)下观察LZTS2的表达。判读标准：由两位经验丰富的高级职称病理医师采用双盲法在高倍显微镜下对染色结果进行观察，主要观察记录阳性细胞率和着色强度，LZTS2阳性主要定位于细胞质/膜。按阳性细胞百分比评分：阳性细胞率<10%为0分，10%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分；按着色强度评分：基本无阳性着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；两项评分相乘为最终得分：0～4分为低表达，>4分为高表达。

1.3.2穿刺方法 甲状腺结节细针穿刺检查均为超声引导下穿刺，操作严格遵循无菌原则。最后将穿刺注射器内部分穿刺物快速推至含有1 mL生理盐水的离心管中用于基因检测。

1.3.3BRAFV600E基因突变检测 使用QIAamp DNA Micro Kit提取穿刺组织DNA，按人类BRAF基因突变检测试剂盒(北京雅康博公司)操作说明，采用PCR法判断基因是否突变。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验及Fisher精确概率法。多因素分析采用Logistic回归分析，LZTS2蛋白表达与BRAFV600E基因突变的关系进行Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TC及结节性甲状腺肿组织中LZTS2的表达LZTS2蛋白主要定位于细胞质/膜(图1)，LZTS2在TC组织中的低表达率为37.14%(52/140)，结节性甲状腺肿中的低表达率为19.51%(16/82)，差异有统计学意义(χ2=7.565，P<0.05，表1)。此外，实验组LZTS2在甲状腺滤泡癌、未分化癌中的低表达率(41.46%、100%)与结节性甲状腺肿(19.51%)相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 TC及结节性甲状腺肿组织中LZTS2的表达[n(%)]

ABC图1 A.甲状腺乳头状癌中LZTS2高表达,EnVision法;B.结节性甲状腺肿中LZTS2高表达,EnVision法;C.甲状腺未分化癌中LZTS2低表达,EnVision法

2.2 LZTS2蛋白表达与TC临床病理特征的关系TC组织中LZTS2蛋白表达与患者年龄、TNM分期、组织学类型、肿瘤直径及病灶数目有关(P<0.05)；与患者性别、淋巴结转移及双侧甲状腺受累均无关(P>0.05，表2)。多因素Logistic回归分析显示，LZTS2蛋白低表达与TC不同组织学类型显著相关(OR=0.33，95%CI：0.16～0.72，P<0.05)。

表2 LZTS2蛋白表达与TC临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 BRAFV600E基因突变检测实验组中67例TC患者行超声引导下甲状腺结节细针穿刺新鲜组织检测BRAFV600E基因突变情况。甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变率为95.45%(42/44)，髓样癌及滤泡癌均未合并BRAFV600E基因突变。单因素分析显示，BRAFV600E基因突变与TC不同组织学类型具有相关性(P<0.001，图2、3)。

图2 A.甲状腺乳头状癌HE染色；B.荧光PCR检测示BRAFV600E基因突变型

图3 A.甲状腺未分化癌：梭形肿瘤细胞间质内弥漫浸润性生长；B.荧光PCR检测示BRAFV600E基因野生型

2.4 LZTS2表达与BRAFV600E基因突变的关系本组TC中LZTS2蛋白表达与BRAFV600E基因突变无明显相关性(r=0.225，P=0.067，表3)。

表3 TC中LZTS2表达与BRAFV600E基因突变的关系[n(%)]

3 讨论

TC属于头颈部常见的恶性肿瘤，发病率逐年升高，主要与临床影像学检查的普及、细针穿刺细胞学诊断水平的提高有关[11]。TC组织学类型包括乳头状癌、滤泡癌、未分化癌及髓样癌，其中以乳头状癌最为常见且患者预后较好，未分化癌患者预后最差[12]。目前TC发生、发展机制尚不完全明确，深入探讨TC可能的发生机制，可为TC的早期预防及后期治疗提供更多实验依据，且对于改善患者预后有重要临床意义。

LZTS属于富含亮氨酸重复序列超家族蛋白，主要包括LZTS1和LZTS2。LZTS2是近年发现的包含3个亮氨酸拉链结构域的蛋白，LZTS2/LAPSER1基因位于人类染色体10q24.3[13]。LZTS2蛋白N-末端的PGS富集区和SGP富集区和C-末端的谷氨酸富集区是其结合于各转录因子的重要结构，其含有3个结构域可以直接结合DNA的启动子或增强子，调控基因的转录。LZTS2蛋白在很多正常组织中高表达，但在肿瘤组织(如肺癌、结肠癌、胶质瘤及前列腺癌等)中低表达，也提示LZTS2可能是一种发挥抑癌作用的蛋白[14]。但有关LZTS2蛋白在TC组织中的表达及生物学作用尚未见报道。本实验通过免疫组化法检测TC及结节性甲状腺肿组织中LZTS2蛋白的表达，结果显示TC组织中LZTS2蛋白显著低表达，与文献报道一致。Cui等[6]研究发现，非小细胞肺癌中LZTS2/LAPSER1表达率较低，且LZTS2/LAPSER1过表达与非小细胞肺癌类型、肿瘤状态和淋巴结侵袭情况有关。本组通过单因素分析发现，TC组织中LZTS2低表达与组织学类型(滤泡癌低表达率41.46%、未分化癌低表达率100%)有相关性，且多因素分析结果显示组织学类型是LZTS2低表达的独立影响因素，与以往研究认为LZTS2主要发挥抑癌作用的观点一致。但本实验还发现，甲状腺乳头状癌、髓样癌组织中LZTS2蛋白高表达，与部分文献报道不一致[7]，考虑可能与TC病变发生发展过程中存在LZTS2/LAPSER1基因突变的现象有关。LZTS1和LZTS2属于同一家族的抑癌基因，王欣欣等[15]通过对肝癌中LZTS1蛋白表达的研究发现，对比正常肝细胞，肝癌细胞系HepG2中LZTS1表达反向增强。由此作者考虑LZTS2蛋白在部分TC组织中可能也存在类似的反向表达，但仍需后续进一步深入研究证实。本组LZTS2蛋白表达与患者年龄、肿瘤TNM分期、肿瘤直径及病灶数目有相关性，提示LZTS2蛋白表达可能与TC病情进展及患者预后有关。

作为RAF基因家族中的一种，BRAF基因突变见于多种疾病，尤以BRAFV600E基因突变与TC发生最具相关性，甲状腺恶性结节(乳头状癌)中BRAFV600E基因突变率为64.58%，而良性结节不合并BRAFV600E基因突变[16]。本组甲状腺乳头状癌BRAFV600E基因突变率为95.45%(42/44)，高于文献报道结果，可能与研究对象选择、样本量及检测方法不同等因素有关。研究发现[10]LZTS2/LAPSER1基因与相关基因或蛋白在肿瘤的发生发展过程中存在协同或抑制作用。本实验结果显示LZTS2蛋白表达与BRAFV600E基因突变不具有相关性，提示两者在TC发生、发展过程中可能各自发挥不同的影响作用。

综上所述，本组通过免疫组化法、单因素及多因素分析发现，LZTS2蛋白在TC组织(滤泡癌、未分化癌)中呈低表达，间接证实在甲状腺组织中LZTS2也是一种发挥抑癌作用的蛋白。LZTS2蛋白表达与BRAFV600E基因突变不具有相关性，两者在TC发生、发展过程中可能各自发挥不同的作用，LZTS2有望成为TC早期预警生物学标志物。有关LZTS2在TC中的具体作用机制尚不清楚，尚需进一步的实验来验证。