EBER原位杂交和免疫组化双染中酶消化和抗原修复的优化

何 娇，罗陆侨，廖集琴

原位杂交和免疫组化双染技术是在不同层次来检测同一细胞上某些物质的表达是否有相关性的一种实验方法。由于操作步骤复杂，实验不易取得理想效果。我科结合本实验室实际情况，经过反复摸索，获得满意效果，现将我科经验总结如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源收集广东省人民医院病理科2019年1～5月EBER阳性病例16例，其中NK/T淋巴瘤 8例，Burkitt淋巴瘤2例，血管免疫母细胞性淋巴瘤4例，浆母细胞性淋巴瘤1例，淋巴结外周T细胞淋巴瘤1例。所有标本均及时固定及规范化取材，经10%中性福尔马林固定。

1.2 试剂EBER原位杂交试剂盒购自北京中杉金桥公司，AP免疫组化试剂盒购自徕卡公司，CD3、CD20一抗购自上海基因公司。

1.3 方法

1.3.1预实验1 将组织连续4 μm厚切片4张，65 ℃烤片1 h，根据酶消化时间不同分为4个实验组(表1)，先进行EBER原位杂交单染。

表1 预实验1方法及结果

1.3.2预实验2 根据预实验1结果，选取胃酶消化12 min和16 min，再将实验分为8组(表2)，进行第二步免疫组化染色。

表2 预实验2方法及结果

1.3.3原位杂交和免疫组化双染 根据预实验1和预实验2的染色结果，实验条件有所改进：(1)切片脱蜡，无水乙醇洗3次，每次4 min，空气中干燥切片。(2)滴加胃酶消化12 min，95%乙醇洗4 min，无水乙醇洗4 min，空气中干燥切片。(3)滴加EBER探针，加盖玻片，置于37 °C恒温水浴箱中孵育3 h，揭开盖玻片，PBS洗2次，每次4 min。(4)滴加地高辛二抗，室温孵育30 min，PBS洗2次，每次4 min，DAB显色5 min，PBS洗3 min。(5)免疫组化检测在Leica Bond Ⅲ全自动免疫组化仪上进行，ER2修复12 min，PBS洗5 min×2。(6)一抗孵育55 min，PBS洗5 min×2。(7)Post primary AP孵育15 min，PBS洗5 min×2,Primary AP孵育15 min，PBS洗5 min×2。(8)快红显色10 min，苏木精复染，干燥切片，中性树胶封固。

1.4 判读方法EBER原位杂交阳性为细胞核呈棕色，免疫组化阳性为胞膜呈红色，双染阳性者为同一细胞中细胞核呈棕色，细胞膜呈红色。

2 结果

组织结构完整，EBER原位杂交阳性为细胞核呈棕色，免疫组化阳性为胞膜呈红色，每个切片中均可见双染阳性细胞，染色效果满意(图1、2)。

①②

3 讨论

EBV属于疱疹病毒，是传染性单核细胞增多症的原因，也与自身免疫病和多种肿瘤相关，如Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、毛细胞白血病和原发性中枢神经系统淋巴瘤[1]。在淋巴组织中，EBV可感染B、T及NK细胞，与其多种疾病有关[2]。EBV原位杂交法是检测病理组织或细胞涂片中EBV病毒的常用检测方法。原位杂交检测EBER能够定位EBV感染的细胞类型，是明确肿瘤与EBV相关的金标准[3]。但有时在淋巴瘤病理诊断中，单纯性原位杂交和单纯性免疫组化的基础上难以精准判读EBV阳性细胞的种系，给诊断带来一定的困难。此时应用双染技术，可以在同一张切片上清晰地观察到EBV阳性细胞是T淋巴细胞还是B淋巴细胞，有利于组织学判读，从而更加容易做出明确诊断[4]。

酶消化是原位杂交检测成功与否的关键步骤。其目的是去除靶核酸周围的蛋白质，增加组织的通透性，暴露靶基因，有利于探针渗透，增强杂交信号强度[5]。在单纯性的EBER原位杂交检测中，试剂盒推荐的酶消化时间为30 min，但作者发现，在EBER原位杂交和免疫组化双染实验中，如果先消化30 min后免疫组化再稍加修复，免疫组化染色大部分没信号或信号极弱，细胞结构往往不完整，呈修复过度状态；如果免疫组化不修复，细胞结构比较完好，但免疫组化染色太弱或没信号，达不到染色要求。经过反复摸索，作者首先就不同的酶消化时间对EBER原位杂交结果的影响进行比较，发现酶消化12、16、20 min，EBER原位杂交染色信号均够强，背景干净，达到染色要求。

在预实验2中，双染中的免疫组化在全自动免疫组化仪上完成，操作简单，缩短了检测时间。由于第一步原位杂交中组织已经过一次预处理，相比免疫组化单染，双染中的免疫组化只能采用较短的修复时间，才能既保证细胞结构完好，又能取得满意的免疫组化染色结果。

检测中还需注意以下几点：(1)切片脱蜡后，经无水乙醇洗去二甲苯即可，无需经低浓度乙醇，酶消化前需干燥切片，防止有水稀释酶的浓度。(2)EBER探针可在37 ℃水浴箱孵育3 h或在室温孵育过夜，可以取得相同的效果。在实际工作中可以根据实际情况选择时间。(3)相比免疫组化单染，免疫组化双染检测中一抗的浓度需要更高，孵育时间更长，以增加抗原抗体的结合。(4)中性树胶中含有二甲苯会导致红色显色剂褪色，封片后应尽早采图，防止显色时间过长而褪色。