食管基底细胞样鳞状细胞癌中PD-L1表达及与临床病理的关系

张安莉，李倩倩，李 恒，孙思柏，李玉洁，王 伟，吴海波

食管基底细胞样鳞状细胞癌(basaloid squamous cell carcinoma, BSCC)是一种食管少见的鳞状细胞癌变异亚型，发病率为0.2%～11.3%[1]，具有独特的组织形态特点和明显的侵袭性行为，较普通食管鳞状细胞癌预后更差。细胞程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)免疫治疗是目前备受瞩目的新一代抗肿瘤治疗方法，旨在利用自身的免疫系统对抗肿瘤细胞，通过PD-L1蛋白抗体阻止PD-L1识别T细胞，从而恢复T细胞的正常识别和防御功能，有助于杀死肿瘤细胞[2]。文献报道PD-L1可表达于膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌和淋巴造血系统肿瘤等多种肿瘤，但在食管BSCC中尚未见报道。本文应用免疫组化法检测PD-L1在BSCC中的表达，探讨PD-L1表达与BSCC临床病理特征及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 材料收集2010年7月～2018年12月中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)手术切除的食管癌标本，经病理组织学和免疫组化检查明确诊断食管BSCC合计65例，其中37例有随访资料。纳入标准：(1)患者术前均未行放疗、新辅助化疗和激素类药物治疗，具有手术适应症；(2)经术后组织学和免疫组化检查证实为食管BSCC；(3)临床病理资料及随访资料完整。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)合并心脑血管疾病或严重肝肾功能危及生命者；(3)合并其他重大疾病者。37例食管BSCC中男性32例，女性5例；年龄49～81岁，平均(64.73±7.88)岁；Ⅰ+Ⅱ期26例，Ⅲ+Ⅳ期11例；其中癌组织浸润至黏膜下层4例，肌层6例，外膜层27例；有淋巴结转移者12例，无淋巴结转移者25例。采用电话随访，随访时间截止到2019年6月，随访时间6～112个月，直至患者死亡或随访截止时间。

1.2 方法手术标本均经10%中性福尔马林固定，脱水浸蜡、包埋后切片，分别行HE和免疫组化染色。蜡块4 μm厚切片，行PD-L1免疫组化SP法染色(使用DAKO自动免疫组化染色仪Link48)。所用一抗(PD-L1单克隆鼠抗人，克隆号22C3)、二抗试剂盒(PD-L1抗体22C3 pharmDx)均购自DAKO公司，所有切片均设立阴、阳性对照。

1.3 结果判读两名高年资病理医师采用双盲法进行判读，PD-L1主要表达于细胞膜，呈现部分或完整细胞膜着色。按照PD-L1阳性细胞所占肿瘤细胞总数的百分比评分(tumor proportion score, TPS)进行结果判读[3]。肿瘤相关免疫细胞膜染色、细胞质染色的肿瘤细胞被排除在评分之外。PD-L1高表达定义为TPS>1%。

1.4 统计学分析采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 食管BSCC及癌旁正常组织中PD-L1的表达食管BSCC组织学形态主要由基底样细胞组成，瘤细胞较小，胞质少，核呈圆形或卵圆形，核分裂象多见，癌细胞呈实性巢状排列(图1)。组织学形态与神经内分泌癌相似，免疫组化标记CK5/6、p63、p40均弥漫阳性，Syn、CgA、CD56、CD117均阴性。PD-L1主要表达于细胞膜，呈现部分或完整细胞膜着色(图2)。PD-L1在食管BSCC中的高表达率为29.73%(11/37)，在癌旁正常鳞状上皮中不表达。在PD-L1高表达BSCC中可见PD-L1在肿瘤间质淋巴细胞中也有表达，在PD-L1低表达BSCC中肿瘤间质淋巴细胞几乎不表达PD-L1。

①②

2.2 食管BSCC中PD-L1表达与临床病理特征的关系食管BSCC组织中PD-L1表达与肿瘤浸润深度、临床分期、淋巴结转移相关(P<0.05)，PD-L1表达与患者年龄、性别、肿瘤大小无关(P>0.05，表1)。

表1 PD-L1表达与食管BSCC临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 PD-L1表达与食管BSCC预后的关系Kaplan-Meier生存分析结果表明，PD-L1高表达食管BSCC患者术后总生存期(overall survival, OS)和无进展生存期(progression free survival, PFS)均比PD-L1低表达食管BSCC者明显降低(χ2=13.283，P=0.000 3；χ2=7.700，P=0.006，图3、4)。两组患者中位OS分别为12、24个月，5年生存率分别为27.27%、34.62%；中位PFS分别为8、20个月，5年生存率分别为9.09%、26.92%。

图3 PD-L1表达与食管BSCC患者OS的关系

图4 PD-L1表达与食管BSCC患者PFS的关系

3 讨论

BSCC是一种少见的特殊类型鳞状细胞癌，好发于上呼吸道及上消化道，由Wain等[4]于1986年首次报道，其以明显的侵袭性、较差的预后和独特的病理形态引起广泛关注。早期人们对食管BSCC缺乏认识，易误诊为腺样囊性癌、小细胞癌、低分化鳞状细胞癌、腺鳞癌等，随着对其认识的深入，文献报道的发病率也在逐年增加。本病好发于中老年人，男性多见，本组男性32例，女性5例，平均年龄64.7岁。BSCC的5年生存率为20.2%，与普通食管鳞状细胞癌的5年生存率(40.4%)相比，预后更差[5]。治疗上目前多采取食管根治手术加化疗，但效果不太令人满意。因此在分析BSCC临床病理特征的基础上，积极寻找BSCC有效的治疗方案显得尤为重要。

免疫治疗是继肿瘤分子靶向治疗之后新的研究热点。机体免疫系统在肿瘤发生、发展过程中既能清除肿瘤细胞，又能促进肿瘤免疫逃逸。程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD1)主要表达于活化的T细胞表面，含有288个氨基酸受体，结构域同免疫球蛋白可变区相似，包括胞外N端域、穿膜结构域和胞内结构域3个部分。其胞内结构域在免疫抑制中发挥负性调节作用，介导强效免疫抑制信号，阻碍T效应细胞的分化和功能，对抗病毒和抗肿瘤免疫反应产生的负面影响[6]。PD-L1是由290个氨基酸亚基组成的跨膜蛋白，胞外由1个IgV样区和1个IgC样区构成，二级结构与B7-1、B7-2非常相似。PD-L1是PD1的主要结合配体，PD1与其配体PD-L1结合后，通过抑制T、B细胞活性来防止自身免疫疾病的发生[7]。T细胞共刺激信号通路包括B7-1/B7-2-CD28/CTLA-4超家族，它们对于T细胞活化和耐受必不可少，PD1作为抑制性受体，其配体PD-L1作为B7-1/B7-2-CD28/CTLA-4家族的另一个成员，确立了免疫检查点对维持T细胞免疫耐受的重要性。

浸润和转移是恶性肿瘤的主要特征，也是影响患者预后的主要因素。上皮-间质转化(epithelial-mesmenchymal transition, EMT)是指上皮细胞失去极性，细胞紧密连接及黏附连接消失，Ⅲ型EMT与肿瘤的浸润和转移有关[8]。PD-L1可促进肿瘤细胞转录因子Slug和Twist的表达，抑制E-cadherin表达，从而促进EMT的发生[9]，这表明PD-L1在肿瘤的侵袭、转移过程中起着重要的作用。随着CTLA-4作为潜在的抑制性免疫检查点的发现，PD1/PD-L1抑制通路在治疗上被应用。在肿瘤细胞PD-L1表达已被证明抑制T细胞的活化并可以诱导T细胞凋亡，同时发现特异性封闭PD-L1抗体可以用于治疗各种类型的恶性肿瘤。目前PD-L1已被报道在膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胰腺癌、胃癌、黑色素瘤、胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌和淋巴造血系统肿瘤等多种肿瘤均有表达。在这些肿瘤中，PD-L1高表达常与较短的OS相关。食管BSCC中PD-L1的表达国内外文献尚未见报道，针对食管癌的免疫治疗也尚未明确。在本组实验中，PD-L1在食管BSCC中的高表达率为29.73%(11/37)，在癌旁正常鳞状上皮中不表达。在PD-L1高表达BSCC中可见PD-L1在癌巢间质淋巴细胞中也有表达，在PD-L1低表达BSCC中癌巢间质淋巴细胞几乎不表达PD-L1。食管BSCC组织PD-L1表达与肿瘤浸润深度、临床分期、有无淋巴结转移相关，但与年龄、性别、肿瘤大小无关。PD-L1在肿瘤浸润外膜层中的高表达率显著高于浸润至黏膜下层及肌层。Ⅲ+Ⅳ期食管BSCC中PD-L1的高表达率高于Ⅰ+Ⅱ期。PD-L1高表达患者的淋巴结转移率高。这些结果均提示PD-L1高表达的食管BSCC有更强的侵袭性。Kaplan-Meier生存分析表明，PD-L1高表达食管BSCC患者的OS和PFS均明显低于PD-L1低表达患者，提示PD-L1在食管BSCC的发生、发展中发挥了重要作用，也为食管BSCC患者的治疗带来了新的机会。

目前PD1/PD-L1通路在不同肿瘤临床治疗中取得了20%～90%的有效率。肿瘤和肿瘤微环境高表达PD-L1的患者均对PD1-PD-L1通路阻断治疗有良好的临床反应。同时肿瘤间质和肿瘤中浸润的免疫细胞也有PD-L1的表达。在没有PD-L1表达上调的患者中，对PD1与PD-L1通路阻断治疗则反应差。靶向PD1或PD-L1的抗体已经进入临床治疗，包括Pembrolizumab和Nivolumab。在未经治疗的Ⅲ、Ⅳ期恶性黑色素瘤中Nivolumab联合Iplimumab有效率为57.6%[10]。在用抗PD-L1抗体Atezolizumab治疗的非小细胞性肺癌中，未进行PD-L1免疫组化检测患者中的有效率为15%，而在PD-L1高表达患者中的有效率高达38%[11]。决定抗PD-L1疗效的因素包括肿瘤微环境中免疫细胞PD-L1、肿瘤组织中PD-L1阳性细胞数。不表达PD-L1的肿瘤疗效差，肿瘤组织中浸润的PD-L1阳性免疫细胞少则疗效差。迄今为止，FDA已经批准PD1/PD-L1抑制剂治疗9种恶性肿瘤，其中包括肾细胞癌、肺癌、黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌、鼻咽癌、尿路上皮癌、恶性淋巴瘤、乳腺癌。目前，关于食管癌的免疫治疗尚在研究中。前期研究表明，长时间持续使用PD1/PD-L1抑制剂并不能达到期望的生存率，这可能与PD-L1在食管鳞状细胞癌的阳性率较低有关，食管BSCC的PD-L1表达情况却未见报道，可能与本肿瘤亚型病例数较少有关。肿瘤的免疫治疗包括多个信号通路，因此联合治疗成为肿瘤免疫治疗的新方案。Larkin等[12]研究表明，使用Nivolumab和Iplimumab联合治疗53例晚期黑色素瘤患者，入组患者的客观缓解率为40%，肿瘤体积减少80%。Lussier等[13]使用PD1/PD-L1抗体和抗CTLA-4抗体联合治疗方法，转移性骨肉瘤实验小鼠的PFS约为60%，而单用PD-L1抗体治疗的实验小鼠PFS为0，且只用抗CTLA-4治疗也未显示良好的效果，这表明抗体阻断联合治疗具有协同作用。目前抗CTLA-4抗体与抗PD1或抗PD-L1抗体联合治疗的肿瘤还包括肾细胞癌、非小细胞肺癌、三阴型乳腺癌、膀胱癌等，该类临床实验为肿瘤治疗开启了新思路。

目前，FDA批准认证检测PD-L1表达的抗体包括22C3和SP142，本组实验中使用的PD-L1抗体为22C3，对于PD-L1高表达食管BSCC患者是否可以尝试肿瘤化疗联合免疫治疗，以便给食管BSCC患者提供全新的治疗选择，需要进一步临床分析。