藏药沙棘防治高原红细胞增多症作用机制的网络药理学研究※

李田田，刘 芳，王淑琼，付成冰

(青海大学医学院，青海 西宁 810001)

藏医药经典著作《晶珠本草》记载沙棘“化血并治培根病”[1]，广泛应用于高原红细胞增多症(High Altitude Polycythemia，HAPC)的防治。现代医学研究发现沙棘具有抗氧化、清除ROS、增强机体免疫力等功能[2]。由于沙棘的化学成分复杂，其功能多样致作用机制不明。

网络药理学能够通过构建、分析药物成分-靶点-疾病的网络关系，系统地阐释药物治疗疾病的作用机制，非常适合研究此类传统药物[3]。本研究采用网络药理学的思路方法，筛选沙棘防治HAPC的有效成分，系统地分析其防治HAPC的靶点及通路，为阐明沙棘防治HAPC的作用机制提供参考。

1.数据库与方法

1.1 数据库

TCMSP数据库(http：//www.tcmspw.com)；PharmMapper服务器(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)；UniProt 数据库(https：//www.uniprot.org/)；DrugBank 数据库(https：//www.drugbank.ca/)；David 6.8软件(http：//david.ncifcrf.gov)；KEGG数据库(http：//www.Genome.jp/kegg)；String数据库(http：//string-db.org) 。

1.2 方法

1.2.1 沙棘成分的筛选

进入TCMSP数据库，在搜索栏输入“沙棘”，设置参数DL(药物相似度)≥30%、OB(口服生物利用度)≥0.18筛选获取“沙棘活性成分”的文献资料。

1.2.2 沙棘药物成分靶点的选取

将筛选得到的沙棘化合物以mol2.格式导入PharmMapper服务器进行靶点预测，参数设置如下：

Generate Conformers：Yes；Maximum Generated Conformations：100；Select Target Set：Human Protein Target Only；Number of Reserved Matched Targets：100。获得靶点后，利用UniProt数据库将不规范的靶点名称规范化，获取与沙棘成分相关的靶点及其基因信息。

1.2.3 HAPC靶点的选取

选择与HAPC发病机理相关的关键词输入数据库进行搜索，去掉重复项后获得HAPC靶点。

1.2.4 沙棘防治HAPC作用靶点的获取

将得到的沙棘活性成分的预测靶点与HAPC靶点相对比，找到的共有靶点即为沙棘防治HAPC的作用靶点。

1.2.5 蛋白互作网络(PPI)靶点的构建

将沙棘防治HAPC的作用靶点导入STRING数据库，参数设置如下：

蛋白种类参数：Homo sapiens，其他参数设为默认值，得出靶点蛋白互作网络图。

1.2.6 基因本体(GO)富集与KEGG通路的分析

将沙棘防治HAPC的靶点导入DAVID6.8软件，进行GO富集、KEGG通路分析，并筛选出沙棘防治HAPC的相关通路。

1.2.7 成分-靶点-通路网络的构建

将筛选所得的沙棘活性成分、作用靶点、通路及相互作用关系的文件导入Cytoscape3.7.2 软件，构建活性成分-靶点-通路网络图。

2.结果

2.1 化合物筛选及靶点预测

在TCMSPW数据库中搜索关键词“沙棘”，获得223个有关文献，筛选(DL≥30%、OB≥0.18)后共得33个(表1)。将此33个有关文献导入PharmMapper数据库，共预测得到262个作用靶点。在DrugBank数据库中搜索与HAPC发病相关的关键词，将搜索关键词得到的HAPC靶点与预测所得262个作用靶点对比，筛掉重复项后共有24个靶点与沙棘防治HAPC有关(表2)。在这24个靶点中，PPARG、PPARD、MIF 、MAOB、ADH5、PDK2、RXRA等与氧化反应有关；MAPKAPK2、PPP5C、MAPK14、MAPK10、AKT1、MAPK8、GSK3B、RHOA、MMP2等与免疫、炎症有关；MAPK14、PPP5C、RXRA、GSK3B、MAPK10、ANG、DAPK1、MAPK8、CYP2C8、RHOA、MAPKAPK2、PRKACA、RORA、PDK2、PRKACA、LTF、ANG、AKR1C3、 AKT1等与细胞生存和凋亡有关。

表1 沙棘的活性成分

续表：

表2 沙棘防治HAPC的相关靶点

2.2 PPI网络构建

为了更好地了解沙棘防治HAPC的作用机制，利用STRING软件绘制沙棘防治HAPC的相关靶点PPI图(图1)，该图共包括24蛋白节点、39条相互作用关系连线，其中4个蛋白节点无相互作用关系。

图1 沙棘防治HAPC的靶点PPI图

2.3 基因本体(GO)富集分析及KEGG通路分析

将本研究得到的24个作用靶点导入DAVID6.8软件进行GO富集分析及KEGG通路分析。通过GO富集分析探讨沙棘预测靶点的功能分布，筛选(P<0.05)后分别取前十项绘制“生物过程”“细胞组分”“分子功能”结果图(图2～4)。通过KEGG分析、预测沙棘治疗HAPC的相关通路，共得53条信号通路。筛选(P<0.05)得到49条信号通路，其中有21条信号通路与HAPC防治相关(表3)。这21条信号通路中与细胞增殖、凋亡相关的通路有9条；与免疫、炎症相关的通路有11条；与血小板功能相关的通路有2条；与氧化反应相关的通路有2条(表4)。由此可见，沙棘防治HAPC与细胞增殖凋亡、免疫炎症反应、氧化应激等多种机制相关。

图2 预测靶点的GO富集分析“生物过程”图

图3 预测靶点的GO富集分析“分子功能”图

图4 预测靶点的GO富集分析“细胞组分”图

表3 沙棘防治HAPC的KEGG通路

续表：

表4 沙棘防治HAPC的KEGG通路分类

2.4 网络构建

利用 Cytoscape3.7.2软件构建沙棘防治HAPC的成分-靶点-通路网络图(图5)。

图5 沙棘防治HAPC的成分-靶点-通路网络图

3.讨论

网络药理学依据系统生物学原理对疾病的发病机制进行阐述，并为理解药物与机体的相互作用提供整体性见解[4]。它的主要功用在于预测药物有效成分、作用靶点、通路，利用生物信息学对药物-靶点-疾病网络进行分析，建立预测模型用于药物治疗疾病的机制研究[5]。

HAPC是因高原低氧环境引起的一种慢性高原病。由于高原地区缺氧，机体为了维持体内各组织器官供氧而代偿性增生红细胞。然而红细胞的过度增生可引起血液粘滞、微循环阻力增加，进而加重组织缺氧[6-7]。目前，现代医学对HAPC的治疗采取改善缺氧、抗栓、抗凝等；传统医学如藏医在防治HAPC方面具有独特优势，主张以健胃益气与活血化瘀法联合治疗HAPC，藏药沙棘以其良好的活血化瘀功效被广泛用于HAPC的治疗当中[8]。综合本研究结果分析，沙棘防治HAPC的主要机制在于：作用于VEGF signaling pathway、Ras signaling pathway、Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection、ErbB signaling pathway、Focal adhesion等通路参与体内细胞的增殖分化、内皮细胞增殖迁移，并维持组织和细胞的稳定；通过调控Fc epsilon RI signaling pathway、Toll-like receptor signaling pathway、TNF signaling pathway、T cell receptor signaling pathway等炎症、免疫相关通路参与细胞因子的产生及分泌，上调免疫细胞表面协同刺激分子，增强机体的免疫力； 通过Leukocyte transendothelial migration通路抑制NADPH氧化酶的激活，减少ROS的生成，保护细胞免受氧化应激的损伤[9]。通过PPAR signaling pathway、cAMP signaling pathway、FoxO signaling pathway 等通路参与调节相关基因表达以及细胞间信息交流，参与抗氧化应激并与其他信号通路相联系。其中，MAPK通路在多种细胞信号通路中具有关键作用，参与细胞增殖分化、凋亡以及细胞对外界刺激的应激反应等多种病理生理过程[10]。可见，沙棘防治HAPC是通过广泛参与细胞过程中的多条代谢通路，调节细胞增殖、分化、凋亡，改善机体炎症反应，减少活性氧的生成，增强机体免疫力及抗应激能力。

本研究采用网络药理学研究方法，获得沙棘活性成分，预测、分析其防治HAPC的靶点，构建靶点-通路-疾病网络、靶蛋白相互作用网络，进行GO富集和KEGG通路分析，初步揭示了沙棘在防治HAPC方面的作用机制。