邻苯二甲酸酯类标准物质在婴幼儿乳粉塑化剂检测中的应用研究

孙 雯，李 杰，杜晓宁，徐仲杰，潘 洁，尤雅芳，李美华,*

(1.上海化工研究院有限公司，上海 200062；2.上海计量测试技术研究院，上海 201203)

婴幼儿乳粉作为婴幼儿除母乳之外的主要膳食营养来源，其产品质量直接影响婴幼儿发育。婴幼儿乳粉中的污染物主要有邻苯二甲酸酯类增塑剂、兽药残留、双酚A、壬基酚、重金属等，主要来源于各类原辅料、生产过程中接触的加工设备、管道及管道清洗所残留的清洗剂、消毒剂，设备磨损产生的金属异物，环境迁移，包装迁移等带入产品中[1-3]。其中邻苯二甲酸酯类塑化剂可产生类似于雌激素的作用，在动物体中表现出生殖和发育毒性、诱变性、致癌性和致畸性。2011年卫生部办公厅关于通报食品及食品添加剂中邻苯二甲酸酯类物质最大残留量的函规定食品、食品添加剂中的邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二异壬酯(DINP)和邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)最大残留量分别为1.5 mg/kg、9.0 mg/kg和0.3 mg/kg。我国在2017年6月颁布实施的食品安全领域国家标准 GB 5009.271—2016《食品中邻苯二甲酸酯的测定》中规定对食品中可能残留的16种邻苯二甲酸酯的含量采用气相色谱-质谱联用仪进行检测，同位素内标法或外标法定量[4]。近年来，国内关于邻苯二甲酸酯检测技术研究也大多采用气相色谱-质谱联用法，由于考虑到测试成本，目前塑化剂的检测大多采用外标法[5-10]。据文献报道[1,6]，外标法测定婴幼儿乳粉中16中邻苯二甲酸酯类迁移物其回收率为75.0%～107.6%，在外标法测定松茸中18种邻苯二甲酸酯时回收率为80.23%～118.0%。稳定同位素内标的使用，可消除基质干扰，大大提高分析结果的准确性，有效避免痕量检测中假阳性现象的发生。目前，越来越多的国家标准使用同位素稀释质谱法，如食品中农残、硝基呋喃类代谢物、黄曲霉素等的检测中均采用相应的稳定同位素标记化合物做内标。实验表明，同位素内标的使用消除了基质效应对检测产生的影响，提高了检测方法的回收率。

本研究依据16种邻苯二甲酸酯在气相色谱-质谱联用仪中保留时间的差异，选取6种自制的氘标记邻苯二甲酸酯做内标，对婴幼儿乳粉中16种塑化剂进行定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

气相色谱-质谱联用仪：配备自动进样器和EI离子源，Trace1310 ISQ型，美国Thermo Fisher公司；电子天平：MSA225S型，赛多利斯科技有限公司；超声波清洗仪：KQ-300VDE型，昆山市超声仪器有限公司；冷冻离心机：CT14RDⅡ型，上海天美；纯水仪：Milli-Q，德国Merck公司；正己烷：色谱纯，德国Merck公司；16种邻苯二甲酸酯标准品：纯度≥98%，德国Dr. Ehrenstorfer公司；6种氘标记邻苯二甲酸酯内标：苯环标记，纯度>98.5%，同位素丰度>99.0atom%D，上海化工研究院有限公司；检测样品为8种不同品牌婴幼儿乳粉。

1.2 16种邻苯二甲酸酯混合标准溶液的配制

1.2.116种邻苯二甲酸酯标准储备液(1 000 μg/mL) 准确称取16种邻苯二甲酸酯标准品各10 mg(详细信息见表1)，分别置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解，定容至刻度，得到浓度为1 000 μg/mL的标准储备液。

1.2.216种邻苯二甲酸酯标准中间液(10 μg/mL) 分别准确移取16种邻苯二甲酸酯标准储备液(1 000 μg/mL)100 μL至10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀。

1.2.36种邻苯二甲酸酯-D4内标储备液(1 000 μg/mL) 准确称取6种邻苯二甲酸酯-D4各10 mg，分别置于10 mL容量瓶中，用正己烷溶解，定容至刻度，得到浓度为1 000 μg/mL的内标储备液。

1.2.46种邻苯二甲酸酯-D4内标中间液(10 μg/mL) 分别准确移取6种邻苯二甲酸酯-D4内标储备液(1 000 μg/mL)100 μL至10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，摇匀。

1.2.516种邻苯二甲酸酯标准系列工作液

准确移取16种邻苯二甲酸酯标准中间液(10 μg/mL)，用正己烷逐级稀释，配制成浓度为 0.00 μg/mL、0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.20 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL的标准系列溶液，同时加入内标中间液(10 μg/mL)，使内标浓度均为 0. 125 μg/ mL。

表1 16种邻苯二甲酸酯及其内标的信息Table 1 Information on 16 phthalates and isotopic internal standard

1.3 样品前处理

准确称取乳粉样品0.5 g(精确至0.1 mg)于25 mL玻璃离心管中，加入125 μL 6种邻苯二甲酸酯-D4内标中间液(10 μg/mL)，加入2.5 mL超纯水，混匀，准确加入10 mL正己烷，剧烈振摇1 min，超声提取30 min，1 000 r/min离心5 min，取上层清液，进GC-MS分析。

1.4 GC-MS测试条件

1) 气相色谱。色谱柱： TRACE TG-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm；载气：氦气；流速：1.0 mL/min；进样量：1 μL；进样方式：不分流；进样口温度：260 ℃；柱温：60 ℃保持1 min，20 ℃/min至220 ℃保持1 min，5 ℃/min至250 ℃保持1 min，20 ℃/min至290 ℃，保持7.5 min。

2) 质谱。离子源：EI源；离子源温度：300 ℃；传输线温度：290 ℃；电离能量：70 eV；扫描模式：选择离子扫描(SIM)，16种邻苯二甲酸酯相应定性、定量离子及同位素内标信息详见表2。

2 结果与讨论

2.1 16种邻苯二甲酸酯及婴幼儿乳粉样品SIM模式谱图

本文根据16种邻苯二甲酸酯保留时间的差异，选择6种氘标记邻苯二甲酸酯内标试剂，按照1.2、1.3节方法进行标准溶液配制及样品前处理后，在1.4节的色谱质谱分析条件下分离16种邻苯二甲酸酯的结果示于图1，婴幼儿乳粉样品测试结果如图2所示，图2中保留时间为7.54、10.71、11.61、14.45、16.83、17.05 min处色谱峰为所加入6种邻苯二甲酸酯-D4内标。

表2 16种邻苯二甲酸酯及其相应内标的定性、定量离子Table 2 16 phthalates and their corresponding internal standard of qualitative and quantitative ions

图1 16种邻苯二甲酸酯及6种邻苯二甲酸酯-D4内标SIM模式谱图Fig.1 SIM mode chromatogram of 16 phthalates and 6 phthalates-D4internal standard

2.2 方法线性范围和检出限

1.2.4中配制的16种邻苯二甲酸酯标准系列工作液，经GC-MS分析后，分别以16种邻苯二甲酸酯的浓度与相应内标的浓度比为横坐标，峰面积响应值比为纵坐标，进行线性拟合，得到标准曲线回归方程及相关系数。各组分在0.02 μg/mL～1.0 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。利用信噪比S/N=3、S/N=10分别计算方法的检出限、定量限。所建立检测方法的回归方程、相关系数、检出限、定量限列于表3。

图2 婴幼儿乳品中邻苯二甲酸酯SIM模式谱图Fig.2 SIM mode chromatogram of phthalates in infant milk products

表3 16种邻苯二甲酸酯回归方程、相关系数、检出限、定量限Table 3 Regression equation, correlation coefficient, detection limit and quantitative limit of 16 phthalates

2.3 方法回收率和精密度

向未检出邻苯二甲酸酯的婴幼儿乳粉中分别添加0.05、0.1、0.5、1.0 μg/mL 3个水平的邻苯二甲酸酯标准溶液，按照1.3所述方法进行样品前处理，每个添加水平做6个平行实验，计算回收率和相对标准偏差，结果列于表4。由表4可以看出，在实验所选取的样品基质中，3个不同浓度标准品添加水平的回收率在90.8%～103.6%之间，且相对标准偏差均小于4%。

表4 16种邻苯二甲酸酯检测方法回收率及相对标准偏差(n=6)Table 4 Recovery and relative standard deviation of 16 phthalate detection methods

2.4 婴幼儿乳粉样品测试

采用同位素内标法对市售8个品牌的婴幼儿乳粉样品中16种邻苯二甲酸酯进行了检测，结果显示只有一种品牌乳粉中检出了邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)，含量为0.736 mg/kg。可能由于邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯在工业中应用较为广泛，在乳粉生产、储存过程中发生迁移所致。

3 小结

本文使用自制的6种氘标记邻苯二甲酸酯做内标对婴幼儿乳粉中16中邻苯二甲酸酯进行定量分析。乳粉中加入一定量同位素内标，用超纯水溶解后，正己烷提取，进GC-MS分析。实验表明，基质空白加标在0.05 μg/mL～1.0 μg/mL范围内时回收率为90.8%～103.6%，同外标法相比回收率有明显提高，同位素内标试剂的使用有效消除了基质效应对检测产生的影响，同时使用自制同位素内标试剂代替进口试剂，有助于解决过度依赖进口试剂可能遇到的“卡脖子”问题。