鸡BRD2亚细胞定位及其组织表达特性分析

韩一帆　周磊　袁超　高洪波　王燕碧　赵采芹　唐宏　段志强

摘要：【目的】明確含溴结构域蛋白2（BRD2）的亚细胞定位及其表达特征，为后续研究BRD2基因调控鸡组织发育的作用机制提供参考依据。【方法】通过构建鸡BRD2基因重组真核表达载体pEGFP-BRD2，转染人胚胎肾细胞（HEK-293T）后检测重组蛋白EGFP-BRD2的表达情况及亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR分别检测鸡胚14胚龄（E14 d）、鸡出壳后1日龄（1 d）、7日龄（7 d）和14日龄（14 d）4个时间点各组织中BRD2基因的表达情况。【结果】重组真核表达载体pEGFP-C1-BRD2转染HEK-293T细胞获得的融合蛋白EGFP-BRD2约115.00 kD，且主要定位在细胞核。实时荧光定量PCR检测结果表明，鸡BRD2基因在E14 d和1 d肌胃中的相对表达量最高，在7和14 d肺脏中的相对表达量最高。BRD2基因在各组织的表达规律为：在眼球内E14 d到14 d的表达先下降后趋于稳定;在脑组织和心脏内的表达在E14 d至14 d间呈先下降后上升的变化趋势;在肝脏内E14 d表达稳定，1 d后开始逐渐增加，至14 d时达最高值;在肺脏中E14 d的表达下降，1 d后急剧上升，至14 d时达最高值;在肌胃和胸肌中，均在7 d时最高，1 d时最低，E14 d和14 d时有较高表达，整体上呈倒N表达模式;在腿肌中，从E14 d到1 d表达减少，而后略有增加，7 d后开始下降，至14 d时降到最低值。【结论】鸡BRD2基因重组真核表达载体能在HEK-293T细胞中正确表达，且融合蛋白主要定位在细胞核;BRD2基因在鸡不同发育阶段的各组织中均有表达，但其表达量呈现不同的变化趋势。

关键词： 鸡;含溴结构域蛋白2（BRD2）;亚细胞定位;表达规律;组织发育

中图分类号： S831.2                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）08-1857-07

Subcellular localization of chicken bromodomain-containing protein 2（BRD2） and its expression characteristics

HAN Yi-fan， ZHOU Lei， YUAN Chao， GAO Hong-bo， WANG Yan-bi，

ZHAO Cai-qin， TANG Hong， DUAN Zhi-qiang*

（College of Animal Sciences， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountains Region， Ministry of Education/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and

Reproduction in Guizhou， Guiyang  550025， China）

Abstract：【Objective】This study aimed to investigate the subcellular localization of chicken（Gallus gallus） bromodomain-containing protein 2 （BRD2）and analyze its expression characteristics in different tissues of chickens， which could provide the reference for subsequent research on the mechanism of BRD2 gene regulating chicken tissue development.【Method】The recombinant eukaryotic expression vector PEGFP-BRD2 of chicken BRD2 gene was constructed and transfected into human embryonic kidney cells（HEK-293T）. The expression and subcellular localization of the recombinant protein EGFP-BRD2 were examined by Western blot and inverted fluorescence microscope，respectively. In addition，real-time fluorescence quantitative  PCR（qRT-PCR）was used to detect the expression patterns of BRD2 gene in different tissues at chicken embryo 14 days（E14 d），1-day-old（1 d），7-day-old（7 d），and 14-day-old（14 d）. 【Result】The results showed that pEGFP-C1-BRD2 transfected HEK-293T cells，and the obtained fusion protein EGFP-BRD2 was about 115.00 kD and localized mainly in the nucleus. The qRT-PCR results showed that BRD2 gene had the highest relative expression in the stomach of chicken at E14 d and 1 d，and the lung at 7 d and 14 d. The expression pattern of BRD2 gene in various tissues revealed that the expression of BRD2 gene in the eye ball was first decreased and then stabilized from E14 d to 14 d，while in the brain and heart between E14 d to 14 d showed a trend from decline to increase. As for the liver and lung， it showed the stable expression in the liver on E14 d， gradually increased after 1 d and reached the peak on 14 d; it decreased expression in the lung at E14 d，  began to increase sharply after 1 d and reached the highest level at 14 d. In the stomach and pectoral muscle， the expression pattern of BRD2 gene was inverted N，showing that it was the highest at 7 d and the lowest at 1 d，but had   high expression at E14 d and 14 d. However，in leg muscles， the expression of BRD2 decreased from the E14 d to 1 d， then increased slightly， and began to decrease at 7 d and reached the lowest level at 14 d.【Conclusion】The chicken BRD2 gene recombinant eukaryotic expression vector is correctly expressed in HEK-293T cells and the fusion protein is mainly located in the nucleus. The qRT-PCR result shows that the chicken BRD2 gene is expressed in various tissues at different stages of chicken development， but its expression level shows different trends.

Key words： chicken; bromodomain-containing protein 2（BRD2）; subcellular localization; expression regulation; tissue development

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960698，31760732）; Guizhou Science and Technology Planning Project（QKHPTRC〔2017〕5788）

0 引言

【研究意义】含溴结构域蛋白2（Bromodomain-containing protein 2，BRD2）又称RING3（Really inte-resting new gene 3 protein）（Denis and Green，1996），是一种能特异性识别乙酰化赖氨酸残基的保守蛋白，具有2个串联的N-末端溴结构域（Bromodomain，BD）和1个保守的C-末端外结构域（Extra-terminal domain，ET）。其中，BD结构域是组蛋白乙酰转移酶的结构模块，也是唯一可识别和结合发生组蛋白乙酰化赖氨酸残基的结构域（Sanchez and Zhou，2009）;而ET结构域是转录复合物与乙酰化组蛋白结合为基因转录的主要调节器。BRD2在基因表达和表观遗传方面发挥重要作用，可调节转录水平（Peterson and Laniel，2004），参与细胞周期过程。因此，对鸡BRD2基因进行表达及相关分析可为后续研究BRD2基因调控鸡组织发育的作用机制打下基础。【前人研究进展】BD结构域是一种在物种进化上高度保守的结构域，最早由Tamkun等（1992）发现并定名，一般由60～110个高度保守的氨基酸残基组成，其中含有4个反向平行的α-螺旋（αZ、αA、αB和αC），通过2个可变柔性环状结构（Variable-loop）将这4个α-螺旋两两相连，第一个环状结构连接αZ和αA，因此被称为ZA loop，另一个环状结构连接αB与αC，而被称为BC loop;ZA loop和BC loop结合成一个左旋结构域，几个α-螺旋的末端2个环状结构共同组成与核小体组蛋白中乙酰化赖氨酸相互作用的疏水口袋（Filippakopoulos et al.，2012）。由于BD结构域可识别和结合组蛋白乙酰化的赖氨酸，因此BRD2也是表观遗传领域研究的主要方向之一（Ferri et al.，2016）。已有研究表明，BRD2在果蝇（Drosophila melanogaster）、小鼠（Mus musculus）及人类（Homo sapiens）的胚胎生长发育过程中起重要调控作用，特别是在神经系统的发育过程中作用较明显，如BRD2基因在神经系统胚胎早期的发育过程中呈高度表达，当神经元增殖后，BRD2基因能利用基因调控的方式丰富新生神经元细胞种类（Crowley et al.，2004）。张学思（2015）对成年小鼠的大脑皮质进行研究时发现BRD2基因主要表达于神经元中，同样提示BRD2对成年动物神经元发育起调控作用。BRD2蛋白参与抗原呈递加工、调控免疫应答、诱导免疫反应和抑制细胞活性等免疫调节（Taniguchi，2016）。BRD2蛋白可作为转录调节因子通过调节相关细胞周期蛋白，如Cyclin A、Cyclin E和Cyclin D及激活E2F转录因子等调控细胞周期（Sinha et al.，2005）。此外，BRD2被认为与多种疾病有关，如与青少年肌阵挛性癫痫相关（Pathak et al.，2018），在慢性炎症和胰岛素抵抗中发挥作用（Sun et al.，2017），或抑制BRD2表达可阻止部分肿瘤的发展（Sherman et al.，2017;周晓和程志祥，2019）。【本研究切入点】鸡BRD2基因位于鸡16号染色体主要组织相容性复合体（MHC）中MHC-B的核心区域（Miller et al.，1996），属于MHC-Ⅱ类分子，与机体免疫调控相关。目前，有关BRD2的研究主要集中在人类和小鼠，对果蝇也有一些研究，但鸡BRD2基因克隆、亚细胞定位及其在鸡发育过程不同组织中的表达特征尚不清楚。【拟解决的关键问题】通过克隆鸡BRD2基因并构建其重组真核表达载体pEGFP-BRD2，转染人胚胎肾细胞（HEK-293T）进行表达与亚细胞定位分析;并通过实时荧光定量PCR检测BRD2基因在鸡不同发育阶段不同组织中的表达情况，为后续研究BRD2基因调控鸡组织发育的作用机制提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 供试动物

SPF受精鸡蛋购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司，在实验室自行孵化。在鸡胚发育第14 d（E14 d）及出壳后第1 d（1 d）、第7 d（7 d）和第14 d（14 d）4个时期各随机选取3枚鸡胚或3只小鸡，分别采集眼球、脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肌胃、胸肌和腿肌8个组织样品，保存于-80 ℃用于总RNA提取。

1. 2 细胞、载体和试剂

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞、真核表达载体pEGFP-C1、HEK-293T细胞由贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室保存提供。组织RNA提取试剂盒购自OMEGA公司;2×Realstar Green Fast Mixture、DL5000 DNA Marker和反轉录试剂盒购自北京康润诚业生物科技有限公司;质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自Axy-Gen公司;质粒小量提取试剂盒购自QIAGEN公司;限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ及DNA高保真聚合酶购自Thermo Fisher公司;DMEM高糖培养基和胎牛血清购自Gibco公司;FuGENE?HD Transfection Rea-gent购自Promega公司;1×RIPA细胞裂解液（弱）、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5X）、30% Acr-Bis（29∶1）、预染蛋白质分子量标准和超敏ECL化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所;HRP标记的抗GFP鼠单克隆抗体购自Proteintech公司。

1. 3 引物合成

根据鸡BRD2基因（GenBank登录号XM_01529 4960）核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0设计鸡BRD2基因的PCR扩增引物和实时荧光定量PCR擴增引物，以鸡GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）基因作为内参基因。所有引物（表1）均委托昆泰锐（武汉）生物技术有限责任公司合成。

1. 4 重组真核表达载体pEGFP-BRD2构建

以鸡胚成纤维细胞总RNA反转录后的cDNA为模板，利用特异性引物BRD2-F/BRD2-R扩增BRD2基因。PCR反应体系25.0 μL：cDNA模板4.0 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.0 μL，MgSO4 1.5 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，Pfu Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加ddH2O补足至25.0 μL。扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 40 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，进行30个循环;72 ℃延伸10 min。胶回收后的PCR产物和真核表达载体pEGFP-C1分别用XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切，胶回收目的片段后进行连接，将转化产物涂布在含卡那霉素的LB培养基上。挑取单菌落扩大培养，首先采用菌液PCR进行鉴定，然后提取疑似阳性菌质粒并进行双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒送至重庆擎科兴业生物技术有限公司测序。

1. 5 融合蛋白表达分析

将HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板内进行培养，等待细胞汇合度达80%左右时，采用脂质体转染法对pEGFP-BRD2和pEGFP-C1分别进行转染。至转染后36 h，用1×RIPA细胞裂解液对细胞进行裂解，并于4 ℃下离心收集上清液，加入适量蛋白上样缓冲液处理后进行SDS-PAGE，将蛋白转印至PVDF膜上。PVDF膜在4 ℃下使用5%脱脂乳封闭2 h，加入经1∶12000稀释的HRP标记的抗GFP鼠单克隆抗体在4 ℃下孵育过夜，随后用TBST洗涤3次，使用ECL化学发光试剂盒进行显色并拍照。

1. 6 融合蛋白亚细胞定位分析

将培养的HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板进行培养，待细胞密度达80%左右，采用脂质体转染法将pEGFP-BRD2和pEGFP-C1分别转染HEK-293T细胞，培养24 h后弃6孔板中的细胞培养液，PBS浸洗3次;加入4%多聚甲醛固定细胞20 min，PBS浸洗3次;加入0.25% TritonX-100室温破膜5 min，PBS浸洗3次;加入DAPI避光孵育5 min，PBS浸洗3次，最后置于倒置荧光显微镜下采集图片。荧光图片用Photoshop CS5进行Merge处理。

1. 7 总RNA提取及cDNA合成

根据OMEGA试剂盒说明分别提取4个时期鸡眼球、脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肌胃、胸肌和腿肌的总RNA并进行反转录。反转录过程按照北京康润诚业生物科技有限公司反转录试剂盒说明进行操作。反应体系20.0 ?L：1000 ng/?L RNA模板1.0 ?L、50 ?mmol/L Oligo dT Primer 1.0 ?L、DEPC-ddH2O 7.0 ?L、2×Reaction Mix 10.0 ?L、StarScript II RT Mix 1.0 ?L。反应条件：65 ℃ 5 min;42 ℃ 50 min;85 ℃ 5 min。

1. 8 BRD2基因在鸡不同发育阶段各组织中的表达分析

以反转录合成的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR检测BRD2基因在鸡发育不同阶段不同组织中的表达情况。反应体系20.0 ?L：2×Realstar Green Fast Mixture 10.0 ?L，上、下游引物（10 ?mol/L）各0.5 ?L，cDNA模板1.0 ?L，ddH2O 8.0 ?L。扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 15 s，退火30 s，72 ℃ 30 s，40个循环后进行熔解曲线分析，温度以5 ℃/s的速率从65 ℃递增至95 ℃。

1. 9 统计分析

运用2-ΔΔCt法对实时荧光定量PCR检测数据进行计算分析。具体公式为：ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因，选取眼球组织为对照，计算各组织样品的ΔΔCt值，运用2-ΔΔCt对目的基因的相对表达量进行计算，并利用SPSS 18.0进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2. 1 重组真核表达载体pEGFP-BRD2鉴定结果

以鸡胚成纤维细胞总RNA反转录合成的cDNA为模板，利用特异性引物成功扩增得到与预期大小相符的鸡BRD2基因条带（图1-A）。将PCR产物胶回收后与真核表达载体pEGFP-C1分别进行双酶切，再次进行胶回收、连接和转化，然后在含卡那霉素的LB培养基上挑取单菌落进行扩大培养，经菌液PCR鉴定，鉴定正确的菌液提取质粒，通过双酶切鉴定分别得到4700 bp左右的载体条带和2340 bp的目的基因条带（图1-B）。测序结果显示，鸡BRD2基因正确插入到真核表达载体pEGFP-C1中，未发生阅读框的移码和基因突变，表明重组真核表达载体pEGFP-BRD2构建成功。

2. 2 融合蛋白表达分析结果

为了解融合蛋白EGFP-BRD2在HEK-293T细胞中是否正确表达，利用Western blotting对其进行检测。结果（图2）显示，重组真核表达载体pEGFP-BRD2转染HEK-293T细胞后可获得大小为115.00 kD左右的目的蛋白条带，与预估结果（EGFP为28.00 kD，BRD2为85.66 kD）相符合;而空载体pEGFP-C1转染HEK-293T细胞后获得的蛋白条带位于28.00 kD附近，说明融合EGFP-BRD2在HEK-293T细胞中成功表达。

2. 3 融合蛋白亚细胞定位分析结果

为了解融合蛋白EGFP-BRD2在细胞中的亚细胞定位情况，将重组真核表达载体pEGFP-BRD2和空载体pEGFP-C1分别转染HEK-293T细胞，利用倒置荧光显微镜观察融合蛋白的细胞荧光。结果（图3）显示，EGFP蛋白呈绿色荧光，DAPI染核后呈蓝色荧光，两者不完全重合;而融合蛋白EGFP-BRD2呈现的绿色荧光与DAPI染核的蓝色荧光完全重组，表明融合蛋白EGFP-BRD2定位在细胞核。

2. 4 BRD2基因在鸡不同发育阶段各组织中的表达规律分析结果

采用实时荧光定量PCR检测鸡BRD2基因在E14、1、7和14 d各组织中的相对表达量，探究BRD2基因在鸡不同发育阶段各组织中的表达规律。结果（图4）表明，鸡BRD2基因在E14 d的各组织中均有表达，其中肌胃中的相对表达量最高，肝脏中的相对表达量最低，各组织相对表达量排序为：肌胃>肺脏>眼球>心脏>腿肌>脑组织>胸肌>肝脏;在1 d的各组织中，BRD2基因在肌胃中的相对表达量最高，胸肌中的相对表达量最低，各组织相对表达量排序为：肌胃>眼球>肺脏>肝脏>腿肌>心脏>脑组织>胸肌;在7 d的各组织中，BRD2基因在肺脏中的相对表达量最高，且显著高于其他组织（P<0.05，下同），其次是肌胃，在脑组织中的相对表达量最低，各组织相对表达量排序为：肺脏>肌胃>肝脏>胸肌>心脏>眼球>腿肌>脑组织;在14 d的各组织中，BRD2基因在肺脏中的相对表达量最高，显著高于其他组织，在肝脏中的相对表达量其次，胸肌中的相对表达量最低，各组织相对表达量排序为：肺脏>心脏>肝脏>肌胃>眼球>脑组织>腿肌>胸肌。

对鸡BRD2基因在不同发育阶段各组织中的表达规律进行分析，结果（图5）显示，从E14 d到14 d，BRD2基因在眼球内的表达先下降后趋于稳定;在脑组织和心脏的表达呈先下降后上升的变化趋势;在E14 d的肝脏内表达稳定，从1 d开始逐渐增加，至14 d时达最高值;在肺脏中表现为1 d后急剧上升，至14 d时达最高值;在肌胃和胸肌中均在7 d时最高，1 d时最低，E14 d和14 d时有较高表达，整体表达呈倒N模式;在腿肌中，BRD2基因从E14 d到1 d的表达减少，而后略有增加，7 d之后开始下降，在14 d时降至最低值。

3 讨论

含溴结构域蛋白共分为8个亚族，BRD2是第二亚族（Sub-family II）溴结构域和超末端结构域（Bromodomain and extra-terminal domain，BET）蛋白家族成员（Lloyd and Glass，2018）。作为BET家族成员之一，BRD2蛋白具有2个串联的N-末端BD结构域和1个保守的C-末端外ET结构域。BET成员虽具有相似结构，但各成员间的生物学功能存在一定差异。已有研究表明，BRD2通过在体内外与组蛋白H4第12位乙酰化的赖氨酸结合（Kanno et al.，2004），作为“读者”（Reader）参与乙酰化修饰过程。乙酰化修饰作为一种翻译后修饰调控机制在细胞核或细胞质的亚细胞器内广泛存在（杨雨薇等，2019）。相关研究表明，人类的BRD2蛋白存在于细胞核内（Denis and Green，1996），小鼠的BRD2蛋白也位于细胞核中（Guo et al.，2000）。本研究通过将BRD2基因插入真核表达载体pEGFP-C1中，构建重组真核表达载体pEGFP-BRD2，并转染HEK-293T细胞进行表达，结果发现融合蛋白EGFP-BRD2主要定位在细胞核，而EGFP蛋白定位在细胞核和细胞质中，表明鸡BRD2蛋白存在于细胞核内。此外，通过核定位信号预测及与已报道的人类BRD2蛋白核定位信号氨基酸序列比对分析，发现鸡BRD2蛋白核定位信号位于500KKKKKKSEKHK510，为后续研究鸡BRD2蛋白细胞核定位的分子机制提供了基础。

在果蝇、小鼠和人类的生长发育相关研究中，发现BRD2同样发挥重要的调控作用，在神经系统发育过程中BRD2基因会在增殖的神经元祖细胞中表达，细胞周期表现刺激活性，过量表达时会抑制神经元的分化（Garcia-gutierrez et al.，2014）。在已分化的神经元细胞中也能检测到BRD2基因表达。当大脑内所需关键神经元细胞减少则会导致BRD2不足（Velí?ek et al.，2011），若BRD2发生缺失，将会引起神经前体细胞的增殖變多，严重者会导致神经管延迟闭合（Gyuris et al.，2009），甚至是胚胎的早期死亡（Shang et al.，2009）。通过人类、小鼠和斑马鱼的研究发现，BRD2基因在卵巢、睾丸、卵子、早期胚胎和神经系统发育时高度表达（Rhee et al.，1998;Dibenedetto et al.，2008; Shang et al.，2009），且在体内其他组织中也均有表达（Shang et al.，2009），但表达量在不同发育阶段有所不同。

本研究通过实时荧光定量PCR检测BRD2基因在鸡生长发育过程中的表达规律，结果发现BRD2基因在眼球内的表达先下降后趋于稳定，鸡眼球中包括巩膜、角膜、血管膜、睫状体、晶状体、玻璃体、视网膜等，其中视网膜上最后一根神经已达视顶盖（刘黎和苏国辉，1988），其后眼部神经发育基本完全，BRD2基因表达也与这一过程基本一致;BRD2在鸡脑组织中的表达呈先下降后上升的变化趋势，但其变化幅度不明显，可能与脑组织神经的发育有关，E14 d后大脑皮质功能就已出现分区、小脑沟回增多，E20 d时大脑组织发育较快（阿依木古丽等，2011），BRD2基因表达处于较稳定的状态;E8 d时鸡胚的心脏已基本发育完成（张月娟，2004），BRD2基因在心脏的表达与在脑组织的表达规律基本一致;1 d前BRD2基因在肝脏的表达较稳定，1 d后开始逐渐增加，可能是由于肝脏可再生，BRD2蛋白可调节肝细胞再生过程（Russell et al.，2018）;BRD2基因在肺脏中1 d前表达逐渐下降，1 d后急剧上升，在肌胃中BRD2基因表达整体上呈倒N表达模式，虽未有相关研究证实BRD2与二者生长发育有相关联系，但有研究表明BRD2与肺癌、胃癌有联系（Riveiro et al.，2016;Chen et al.，2019）;在胸肌中的表达亦呈倒N模式，BRD2基因在腿肌中的表达呈先下降后上升再下降的模式，二者虽未有相关研究表明与BRD2的相关性，但从相关表现上来看1 d后有一定程度的上升可能与免疫调控相关。可见，本研究为后续揭示BRD2基因调控鸡相关组织发育的作用机制打下了基础。

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（責任编辑 王 晖）

收稿日期：2020-02-19

基金项目：国家自然科学基金项目（31960698，31760732）;贵州省科技计划项目（黔科合平台人才〔2017〕5788号）

作者简介：*为通讯作者，段志强（1985-），博士，副教授，主要从事家禽抗病育种与疫病防控研究工作，E-mail：zqduan@gzu.edu.cn。韩一帆（1996-），研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：715709631@qq.com