FoxO3转录因子在鸡卵巢组织中的表达鉴定

洪永兴　彭腊如　黄振文　徐天鹏　濮黎萍　虞霖田　谢龙　廖玉英　陆阳清

摘要：【目的】明确FoxO3转录因子在不同日龄鸡卵巢组织中的表达模式及其具体定位情况，为后续开展家禽卵泡激活及发育调控等相关机理研究提供科学依据。【方法】在GenBank中搜索鸡与其他物种（鸭、鹅、老鼠、猪、牛及人类）的FoxO3氨基酸序列，通过LaserGene分析鸡FoxO3氨基酸序列与其他物种FoxO3氨基酸序列间的亲缘关系及同源差异情况;利用RT-PCR鉴定FoxO3基因是否在鸡卵巢组织中表达，再采用实时荧光定量PCR检测不同发育阶段鸡卵巢组织中FoxO3基因的表达水平，最后以免疫荧光检测FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位情况。【结果】鸡与鸭和鹅的FoxO3氨基酸序列相似性分别为92.7%和95.3%，基于FoxO3氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示鸡与鸭和鹅的亲缘关系较近，说明FoxO3基因的进化相对较保守。在不同发育阶段的鸡卵巢组织中均能检测到FoxO3基因表达，且FoxO3基因在0日龄鸡卵巢组织中的相对表达量最高，显著高于在其他发育阶段的相对表达量（P<0.05）。在0日龄鸡卵巢组织中未检测到FoxO3蛋白，但在21日龄和成年鸡的卵巢组织中均能检测到FoxO3蛋白;在21日龄鸡卵巢组织中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡细胞周围，在卵泡内部没有表达;而在成年鸡卵巢组织中FoxO3蛋白仅定位于大卵泡细胞边缘，小卵泡细胞内并未发现FoxO3蛋白。【結论】由于鸡和哺乳动物的FoxO3氨基酸序列高度同源，且FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位与在哺乳动物卵巢组织中的定位相似，说明FoxO3在鸡卵巢组织中发挥着与哺乳动物相似的功能，即在卵泡激活与成熟过程中发挥重要作用，因此通过调控FoxO3能有效提高鸡的繁殖性能。

关键词： 鸡;FoxO3转录因子;卵巢;卵泡激活;表达定位

中图分类号： S831.89                          文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）08-1849-08

Identification of expression of FoxO3 transcription factor in chicken ovaries

HONG Yong-xing1， PENG La-ru1， HUANG Zhen-wen1， XU Tian-peng1， PU Li-ping1，

YU Lin-tian2， XIE Long1， LIAO Yu-ying3，  LU Yang-qing1*

（1College of Animal Science and Technology， Guangxi University/State Key Laboratory of Subtropical Agricultural Biological Resources Conservation and Utilization， Nanning  530004， China; 2Guangxi Agricultural Vocational and Technical College， Nanning  530007， China; 3Guangxi Animal Husbandry Research Institute， Nanning  530021， China）

Abstract：【Objective】The expression pattern and specific localization of FoxO3 transcription factor in ovarian tissue of chickens at different ages were determined， providing a basis for the subsequent studies on related mechanisms such as follicular activation and developmental regulation in poultry. 【Method】FoxO3 amino acid sequences of chicken and other species（duck， goose， mouse， pig， ox and human） were searched in GenBank， and the genetic relationship and homologous difference between FoxO3 amino acid sequence of chicken and FoxO3 amino acid sequence of other species were analyzed by Laser Gene. RT-PCR was used to identify whether FoxO3 gene was expressed in chicken ovarian tissue. Then real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect FoxO3 gene expression level in chicken ovarian tissue at different stages. Finally， immunofluorescence was used to detect FoxO3 protein localization in chicken ovarian tissue. 【Result】The similarity of FoxO3 amino acid sequence between chicken and duck and goose was 92.7% and 95.3%， respectively. The phylogenetic tree based on T-PCR similarity also showed that chicken was closely related to duck and goose， indicating that FoxO3 gene was relatively conservative in evolution.FoxO3 gene expression could be detected in different stages of chicken ovarian tissue， and the relative expression level of FoxO3 gene in 0-day-old chicken ovarian tissue was the highest， significantly higher than the relative expression level in other stages（P<0.05）. FoxO3 protein was not detected in the ovarian tissue of 0-day-old chickens， but FoxO3 protein was detected in the ovarian tissue of 21-day-old and adult chi-ckens. FoxO3 protein was mainly localized around the original follicle cells in the ovarian tissue of chicken at 21 days old， but was not expressed in the follicle. FoxO3 was found only at the edges of large follicular cells in adult chicken ova-rian tissue， but not in small follicular cells. 【Conclusion】Since the chicken and mammals FoxO3 amino acid sequence has high homology， the location in the chicken and FoxO3 protein in ovarian tissue is similar to the location in the ovarian tissue in mammals， which indicates thatFoxO3 in chicken ovary organization plays a similar function as mammals.The follicle plays an important role in the process of activation and mature， so through regulating FoxO3 can effectively increase the reproductive performance of chicken.

Key words： chicken; FoxO3 transcription factor; ovary; follicle activation; localization of gene expression

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（31960157）

0 引言

【研究意义】叉头框（Forkhead box，Fox）转录因子最早在果蝇上被发现，其在大肠杆菌及人类细胞中均有表达，可发挥多种生物学效应（Jünger et al.，2003）。Fox家族具有许多亚族，其中O亚家族（FoxO）被称为癌因子或肿瘤抑制因子，在癌症的发生和发展过程中发挥重要作用（张楠和王育，2015;黄林艳等，2019;Gurnari et al.，2019）。FoxO通過不同的信号通路调节细胞生长发育，其中FoxO3在动物卵泡激活及其成熟过程中起调节作用（Pelosi et al.，2013;陈亚楠等，2016;黄坚毅等，2019）。因此，探究FoxO3在家禽卵泡中的生物学作用，对揭示家禽产蛋机理及提高其繁殖性能均具有重要意义。【前人研究进展】目前，已知的FoxO亚家族由FoxO3a（FKHRL1）、FoxO1（FKHR）和FoxO4（AFX）组成，均为PTEN/PI3K/AKT通路的下游效应子（Tran et al.，2003;黄坚毅等，2019），参与细胞增殖、细胞凋亡、抗应激、细胞分化及代谢等多种生物学过程（Accili and Arden，2004;周骅等，2017），但需经磷酸化、乙酰化或泛素化等修饰后才能发挥作用（周振琪，2007;van der Horst and Burgering，2007）。其中，FoxO3a因与人类寿命存在密切联系而引起广泛关注，也被称为长寿基因（Miyamoto et al.，2007;Notas et al.，2012）。FoxO3可通过信号通路调控细胞凋亡相关基因转录，进而促进细胞凋亡（Nepal et al.，2015;Hou et al.，2016;黄坚毅等，2019）。已有研究表明，FoxO3是蛋白降解途径中的激活物，能通过促进肌肉萎缩因子表达而诱导肌肉萎缩（Lee et al.，2004;Sandri et al.，2004）。Castrillon等（2003）研究发现，敲除雌性小鼠FoxO3a基因后表现出全部卵泡激活的卵巢表型，导致卵母细胞死亡、功能性卵巢卵泡早期耗竭和继发性不育，进一步证实FoxO3在卵泡生长最早阶段主要发挥抑制卵泡激活的作用。此外，FoxO3可通过调控细胞周期相关基因来延长细胞周期（Du et al.，2016）。在鸡的相关研究领域，Chen等（2019）研究表明，FoxO3不仅能抑制鸡肝癌细胞系（LMH）增殖，促进细胞凋亡，还与鸡的生长发育存在密切联系;Lee等（2019）通过抑制FoxO3基因在鸡成肌细胞中的表达，发现其成肌细胞增殖率明显低于正常成肌细胞，说明FoxO3具有促进鸡成肌细胞增殖的作用。【本研究切入点】鉴于FoxO3在动物卵泡激活及卵母细胞发育过程中发挥的重要作用，故推测其在鸡卵巢内也具有抑制卵泡激活的作用，即通过控制蛋鸡FoxO3基因表达可增加蛋鸡的产蛋量，但至今有关家禽FoxO3的相关研究仍处于初级阶段，尚未明确其在鸡卵巢中的定位及功能作用。【拟解决的关键问题】通过构建系统发育进化树比对分析家禽（鸡、鸭和鹅）与哺乳动物（猪、牛、小鼠及人类）的FoxO3氨基酸序列相似性，并以实时荧光定量PCR和免疫荧光等方法检测FoxO3基因在不同发育阶段鸡卵巢中的表达模式及其具体定位情况，为后续开展家禽卵泡激活及发育调控等相关机理研究提供科学依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试广西麻鸡（0日龄、21日龄和成年鸡各3羽）购自广西富凤农牧集团有限公司。ProLongTM Gold Antifade Mountant with DAPI（P36931）购自Invitrogen公司，E.Z.N.A Total RNA Kit I（R6834-02）购自OMEGA Bio-tek Inc.公司，Alexa Fluor 488 GOAT A 0.5 ML（A11034）购自Thermo-life公司，EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AE311-04）购自TransGen Biotech公司，TB GreenTM Premix Ex Taq II（RR820A）购自TaKaRa公司，Albumin from Bovine Serum（A9418-50G）购自Sigma公司，4%多聚甲醛购自北京博奥拓达科技有限公司，二甲苯和无水乙醇购自天津富宇精细化工有限公司。主要仪器设备：Milli-Q纯水系统（美国Milli-Q公司），2T-12M型组织脱水机（孝感市亚光医用电子技术有限公司），倒置显微镜TH4-200（日本Olympus公司），免疫荧光系统（日本Olympus公司），CFX96TM Real-Time System（Bio-Rad公司）。

1. 2 生物信息学分析

在GenBank中搜索鸡与其他物种（鸭、鹅、小鼠、猪、牛及人类）的FoxO3氨基酸序列，通过LaserGene分析鸡FoxO3氨基酸序列与其他物种FoxO3氨基酸序列间的亲缘关系及同源差异情况，以MEGA 10.0中的邻接法（Neighbor-joining，NJ）构建系统发育进化树。

1. 3 扩增引物设计与合成

根据GenBank已公布的鸡FoxO3基因序列，利用Primer 5.0设计特异性引物（表1），并委托深圳华大基因股份有限公司合成。

1. 4 总RNA提取及cDNA第一链合成

取鸡卵巢组织块迅速加入液氮研磨至粉末，利用RNA提取试剂盒[E.Z.N.A Total RNA Kit I（R6834-02）]提取总RNA，然后按照反转录试剂盒[Easy-Script? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（AE311-04）]说明将提取的总RNA反转录合成cDNA第一链。

1. 5 PCR扩增

以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系20.0 μL，其中，1.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，PrimeSTAR? Max DNA Polymerase 10.0 ?L，cDNA模板10 ng，加Milli-Q水补足至20.0 μL。扩增程序：98 ℃预变性10 s;98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 5 s，进行40个循环;72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1. 6 实时荧光定量PCR检测

以GAPDH基因为内参基因进行实时荧光定量PCR扩增，反应体系20.0 μL，其中，1.0 μmol/L的上、下游引物各1.0 μL，TB GreenTM Premix Ex Taq II 10.0 ?L，cDNA模板10 ng，加Milli-Q水补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性2 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环;熔解程序：95 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 5 s。

1. 7 免疫荧光定位检测

分别取0日龄、21日龄及成年鸡的卵巢组织，在4 ℃下以4%多聚甲醛固定过夜，经组织脱水机自动脱水、透明及浸蜡后，制作3～5 μm的石蜡切片。参考黄斌等（2018）的方法进行免疫荧光染色：切片经脱蜡梯度复水后，在95 ℃下处理20 min进行抗原修复;以5% H2O2处理切片组织15 min，去除内源性过氧化氢酶;在室温下以3%牛血清白蛋白（BSA）封闭1.5 h，滴加一抗（按说明比例稀释于含5% BSA的PBS中）后置于4 ℃湿盒过夜，滴加碱性磷酸酶标记的二抗（按说明比例稀释于含5% BSA的PBS中）后在室温下孵育1.0 h，再滴加DAPI和放淬灭剂，封片，于荧光显微镜下进行镜检。

2 结果与分析

2. 1 FoxO3基因生物信息学分析结果

为检测家禽（鸡、鸭和鹅）与哺乳动物（小鼠、牛、猪及人类）的FoxO3基因种间差异，采用MegAlign对各物种的FoxO3氨基酸序列进行比对，并基于FoxO3氨基酸序列相似性构建鸡与其他6个物种的系统发育进化树，结果显示，鸡FoxO3氨基酸序列与鸭、鹅、小鼠、牛、猪及人类FoxO3氨基酸序列的相似性分别为92.7%、95.3%、78.5%、79.1%、78.6%和78.9%（图1），从构建的系统发育进化树也可知，鸡与鸭和鹅的亲缘关系较近，聚类在同一分支上（图2），说明FoxO3基因的进化相对较保守。

2. 2 FoxO3基因在鸡卵巢组织中的表达鉴定结果

为检测FoxO3基因在鸡卵巢组织中是否表达，以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果（图3）显示在180 bp附近获得1条明亮的目的条带，经测序证实其为鸡FoxO3基因编码区（CDS）序列片段，说明FoxO3基因在鸡卵巢组织中有表达。

2. 3 鸡FoxO3基因实时荧光定量PCR的熔解曲线

GAPDH基因和FoxO3基因实时荧光定量PCR的熔解曲线如图4所示。GAPDH基因和FoxO3基因的熔点分别为86.0和80.5 ℃，熔解曲线均呈单峰，说明本研究设计的扩增引物特异性强，无引物二聚体等非特异性扩增，即实时荧光定量PCR检测数据准确可信。

2. 4 鸡FoxO3基因实时荧光定量PCR检测结果

从图5可看出，除空白对照未扩增出对应的荧光曲线外，从不同日龄鸡卵巢组织中均能扩增出GAPDH基因和FoxO3基因的荧光曲线，表明总RNA提取质量及cDNA反转录合成效果良好，且实时荧光定量PCR检测结果可信。

2. 5 FoxO3基因在鸡卵巢组织中的表达情况

为检测不同发育阶段鸡卵巢组织中FoxO3基因的表达情况，分别收集0日龄、21日龄和成年鸡的卵巢组织，提取各发育阶段鸡卵巢组织总RNA，采用实时荧光定量PCR测定FoxO3基因的表达量。由于FoxO3基因在原始生殖干细胞（PGCs）中的表达量较低，故将其设为对照样本。如图6所示，在不同发育阶段的鸡卵巢组织中均能检测到FoxO3基因表达，且FoxO3基因在0日龄鸡卵巢组织中的相对表达量最高，显著高于在其他发育阶段的相对表达量（P<0.05）;FoxO3基因在21日龄和成年鸡卵巢组织中的相对表达量差异不显著（P>0.05）。

2. 6 FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位情况

为检测FoxO3蛋白在不同发育阶段鸡卵巢组织中的定位情況，分别收集0日龄、21日龄和成年鸡的卵巢组织，按常规方法制作石蜡切片后进行免疫荧光染色。免疫荧光染色结果表明，在0日龄鸡卵巢组织中未检测到FoxO3蛋白（图7），而在21日龄（图8）和成年鸡（图9）卵巢组织中均能检测到FoxO3蛋白。结合荧光定位来看，在21日龄鸡卵巢组织中FoxO3蛋白主要定位在原始卵泡细胞周围，在卵泡内部没有表达;而在成年鸡卵巢组织中FoxO3蛋白仅定位于大卵泡细胞边缘，小卵泡细胞内并未发现FoxO3蛋白。

3 讨论

哺乳动物的卵母细胞被颗粒细胞紧密包围形成原始卵泡，且在很长一段时间内保持静止状态。FoxO3是维持卵巢储备功能的重要转录因子，严格管控着卵泡募集和激活等过程，以防止早期卵泡储集层过早衰竭（卵巢功能早衰）（Schlessinger et al.，2010;Pelosi et al.，2013）。在原始卵泡和初级卵泡阶段，FoxO3主要分布在卵核内，当卵泡进入次级卵泡阶段，其消失在卵核内而出现在卵泡边缘，暗示FoxO3可能与原始卵泡的激活存在密切联系。此外，在小鼠上通过基因敲除和转基因等手段进一步证实FoxO3基因在原始卵泡激活过程中起调控开关作用（John et al.，2008;Pelosi et al.，2013）。但至今有关FoxO3在禽类卵泡激活及发育方面的研究鲜见报道。

本研究结果表明，在0日龄鸡卵巢组织中能检测到FoxO3基因表达，且其相对表达量显著高于在21日龄和成年鸡卵巢组织中的相对表达量，但免疫荧光检测未发现FoxO3蛋白，可能是由于0日龄鸡卵巢组织中的原始卵泡尚未激活，原始卵泡的生理活动较弱，其转录的mRNA并非直接翻译成蛋白而行使生物学功能，而是储存在细胞中为后续的卵泡激活抑制做准备。在21日龄鸡卵巢组织中，FoxO3基因相对表达量虽然显著低于0日龄鸡卵巢组织，但此时鸡卵巢组织中已出现FoxO3蛋白，且主要分布在原始卵泡周围的颗粒细胞中，而不是存在于原始卵泡内。因此，推测FoxO3在家禽卵巢组织中具有抑制原始卵泡激活，以维持卵巢库存量的作用。大量未激活的原始卵泡聚集在一起构成原始卵泡池，而原始卵泡池大小是衡量雌性动物生育能力的一个重要指标，是生殖寿命的近似决定因素（McGee and Hsueh，2000）。说明FoxO3可能与家禽的产蛋性能直接相关，尤其是蛋鸡的产蛋周期和终生产蛋量。此外，在成年家禽中FoxO3蛋白存在于卵母细胞的外围细胞质中，说明FoxO3由卵泡核向胞质转移，与在哺乳动物上的研究结果（Pelosi et al.，2013）一致，同时暗示FoxO3在禽类卵母细胞的成熟与发育过程中发挥重要作用。FoxO3蛋白在不同发育阶段鸡卵巢组织中的定位差异则说明FoxO3在卵泡发育不同阶段发挥不同功能作用。由于禽类和哺乳动物的FoxO3氨基酸序列高度同源（对应相似性均在78.0%以上），且FoxO3蛋白在家禽卵巢组织中的定位与在哺乳动物卵巢组织中的定位相似，因此推测FoxO3在家禽中发挥着与哺乳动物相似的功能。

本研究对FoxO3基因在鸡卵巢组织中的定位及表达模式进行探究，为后续开展家禽卵泡激活及发育调控等相关机理研究提供了科学依据，即有望通过控制FoxO3来提高鸡的繁殖性能。至今，关于FoxO3调控动物原始卵泡激活的作用机理尚未完全明确。虽然已确定FoxO3是调控原始卵泡激活的重要开关，但其开关作用受何种信号启动仍未知，且FoxO3是直接主动控制触发卵母细胞生长还是通过间接作用方式促进卵泡活化也未明确。现有针对FoxO3功能的研究主要集中在人类（Wang et al.，2010）及小鼠（Castrillon et al.，2003）、猪（Matsuda et al.，2012）和牛（Bromfield and Sheldon，2013）等哺乳动物上，而有关FoxO3对于鸟类、爬行动物及水生动物等的具体功能仍有待进一步探究。

4 结论

由于鸡和哺乳动物的FoxO3氨基酸序列高度同源，且FoxO3蛋白在鸡卵巢组织中的定位与在哺乳动物卵巢组织中的定位相似，说明FoxO3在鸡卵巢组织中发挥着与哺乳动物相似的功能，即在卵泡激活与成熟过程中发挥重要作用，因此通过调控FoxO3能有效提高鸡的繁殖性能。

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（責任编辑 兰宗宝）

收稿日期：2019-09-17

基因项目：国家自然科学基金项目（31960157）

作者简介：*为通讯作者，陆阳清（1976-），博士，研究员，博士生导师，主要从事干细胞及动物繁殖生物技术研究工作，E-mail：38360218@qq.com。洪永兴（1994-），研究方向为动物遗传育种与繁殖，E-mail：455842143@qq.com