高通量固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定人尿中8种环境酚类内分泌干扰物

2020-11-02胡小键杨艳伟

色谱 2020年12期

林潇, 邱天, 张续, 胡小键, 杨艳伟, 朱英

(中国疾病预防控制中心环境与人群健康重点实验室, 中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所, 北京 100021)

双酚类(bisphenols)和三氯生(triclosan)是两类重要的环境酚类(environmental phenols)化合物,被广泛用于塑料、食品接触涂层、个人护理品、药物等各类工业和消费产品中[1-3]。随着这些产品的大量使用,近年来在世界范围内的土壤、空气、室内灰尘、饮用水、食品及生物样本中均可检出这些物质[4-8]。研究显示,双酚类、三氯生等物质在一定程度上具有与持久性有机污染物相类似的“持久性、生物富集性和生物毒性”,是潜在的内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)[9,10]。人群流行病学研究显示这些物质的暴露与多种人类疾病显著相关,如肝损伤[11]、甲状腺功能障碍[12]、卵巢功能障碍[13,14]、肥胖促进作用[15]等。因此,目前已有多个国家对这些物质的使用进行限制[2,16]。

日常生活中,人们可通过呼吸、饮水、皮肤吸收等多途径摄入环境酚。为更准确地评估这些化合物的人群暴露水平,人体生物监测被认为是最为理想的暴露监测及评估手段。目前,美国、德国、加拿大等国家亦均对本国居民开展了大范围的生物监测工作,以评估环境酚类化合物暴露的健康风险。建立灵敏、准确、快速的分析方法对于开展环境酚类物质的内暴露监测及评估十分重要。

环境酚进入人体后,在体内的半衰期较短(4～24 h)[17,18],经葡萄糖苷酸化代谢后,由肾脏排出体外[19]。因此,通常将尿中环境酚的浓度作为评估人体内暴露的依据[20]。目前,国外主要采用美国疾控中心建立的在线固相萃取-液相色谱-串联质谱(Online SPE-HPLC-MS/MS)法对尿中的环境酚类化合物进行测定[21]。该方法的局限性在于在线固相萃取装置在我国普及率不高,无法在我国推广应用。国内多采用离线固相萃取-液相色谱-串联质谱方法测定尿样中的环境酚类化合物[22,23],该方法存在的问题主要包括前处理的效率低、溶剂用量大、样品需求量较大、实验过程中空白较高,影响测定结果的准确性。此外,还有气相色谱-质谱联用法[24],该方法需要对酚类化合物进行衍生化,过程比较繁琐。

基于此背景,本研究建立了8种环境酚类化合物的96孔板离线固相萃取-液相色谱-串联质谱(96-well SPE LC-MS/MS)测定方法。该方法操作简便,定量准确,重现性好,样品处理效率高,空白干扰小,少量样品即可满足分析要求,适用于大批量尿样中常见的8种环境酚类化合物的测定。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(TQ-XS,美国沃特世公司),配有I-Class Plus超高效液相色谱仪;Cascada超纯水机(美国波尔公司); 96孔板固相萃取装置(美国沃特世公司)。Oasis HLB 96孔板(60 mg)购于美国沃特世公司。96孔板离心机(MPC2000,北京鼎昊源科技有限公司)。

双酚A(BPA)、双酚F(BPF)、四溴双酚A(TBBPA),纯度均大于98.5%,购自德国Dr. Ehrenstorfer公司;四氯双酚A(TCBPA),纯度大于97%,购自美国Accustandard公司;双酚S(BPS)、双酚AF(BPAF)、双酚B(BPB)和三氯生(TCS)的质量浓度均为100 μg/mL,购于美国剑桥同位素实验室。双酚A内标(BPA-d16, 1 mg/mL)、四氯双酚A内标(TCBPA-13C12, 50 μg/mL)、四溴双酚A内标(TBBPA-13C12, 50 μg/mL)、双酚S内标(BPS-13C12, 100 μg/mL)、双酚B内标(BPB-13C12, 100 μg/mL)、双酚AF内标(BPAF-13C12, 100 μg/mL)和三氯生内标(TCS-13C12, 100 μg/mL)纯度均为98%,购于美国剑桥同位素实验室。双酚F内标(BPF-d10, 1 mg/mL),纯度98%,购自Toronto Research Chemicals。

乙酸铵、乙酸(MS级,美国赛默飞公司);水、甲醇和乙腈(MS级,德国默克公司)。2 mL玻璃进样小瓶(美国沃特世公司)。β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶购于美国西格玛公司。Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)购于美国沃特世公司,标准参考物质SRM 3672(美国NIST标准物质)。人工尿样购于湖州英创生物科技有限公司。

1.2 溶液配制

用甲醇将固体标准品配制成质量浓度约为100 mg/L的单标储备液。各取一定体积的单标储备液,用甲醇定容至10 mL,其中,TCS质量浓度为40 mg/L,其余7种物质均为10 mg/L。用甲醇逐级稀释得到混合标准序列溶液。

分别取适量各内标溶液,用甲醇稀释,配制质量浓度分别为2.5 mg/L (BPA-d16)、5 mg/L(BPF-d10)、1 mg/L(TCS-13C12)以及0.5 mg/L(其余内标)的内标混合溶液。

表 2 8种目标化合物及同位素内标的质谱检测参数

标准曲线溶液:临用时,分别取50 μL各浓度的标准序列溶液,加入50 μL内标混合溶液和400 μL 50%(v/v)甲醇水溶液,配制得到质量浓度为0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/L的标准曲线溶液(TCS的质量浓度为0、0.4、2、4、10、20、40、100、200 μg/L)。

工作曲线溶液:向9支5 mL离心管中分别加入1 mL人工尿样,加入50 μL各浓度的标准序列溶液,50 μL内标混合溶液,30 μLβ-葡萄糖醛酸苷肽酶/芳基磺酸酯酶和700 μL乙酸铵缓冲溶液(1 mol/L, pH=5.0),与样品一起前处理后,用0.5 mL 50%(v/v)甲醇水溶液复溶,工作曲线标准溶液的质量浓度与标准曲线溶液的质量浓度一致。

1.3 样品前处理

从-80 ℃冰箱中取出冷冻尿样,在4 ℃冰箱中解冻12 h再放置至室温,充分涡旋振荡后取1 mL,加入50 μL内标混合液、800 μL乙酸铵缓冲溶液和30 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶,37 ℃水浴过夜酶解。酶解后的尿样离心(3 000 r/min)后取上清液上样。依次用2 mL甲醇、2 mL水和1 mL乙酸铵缓冲溶液活化平衡固相萃取小柱,然后取样品上清液上样,用1 mL 25%(v/v)乙腈进行淋洗,用2 mL甲醇洗脱。洗脱液经氮气吹干,用0.5 mL甲醇-水(1∶1, v/v)溶液复溶,混匀后在4 400 r/min下离心10 min后进样。

为降低空白干扰,实验所用器具均为玻璃材质,每一批样品做1个工作曲线、2个过程空白和2个质控样(NIST SRM 3672)(吸烟者尿样)。

1.4 色谱-质谱条件

超高效液相色谱柱:Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流动相:A相为水;B相为乙腈。进样量5 μL。柱温40 ℃。流动相梯度见表1。

表 1 UPLC流动相梯度

表 2 (续)

表 3 3种固相萃取柱对BPF和TCS的加标回收率

以各组分的质量浓度为横坐标、定量离子峰面积与内标峰面积比值为纵坐标绘制标准曲线,以内标法计算8种目标化合物的含量。

1.5 质量控制

实验中应尽可能使用玻璃材质的器皿,以降低背景干扰。每批样品检测时,每10～15个样品附带1个质控样品和1个空白样品,用以保证方法的准确性和监控实验中产生的空白污染,同时随机抽取未知样品(10%数量)进行重复测定,用以确保方法的精密度。重复测定样品的RSD不应高于30%。

1.6 样品的采集和储存

采集的尿样应储存在硼硅酸盐玻璃或聚丙烯材质的采样瓶中,使用特氟龙材质的盖子。采样前对采样材料进行空白实验筛查,确认不含测定的目标物。在样品采集的过程中,同时制备3套样品空白。样本采集后,于-20 ℃冷冻,并储存在干冰中运输。在实验室中,样本在-80 ℃冰箱中保存。在样品分析的同时分析采样空白(采样地水样)、过程空白(50 μL内标混合液、800 μL乙酸铵缓冲溶液和30 μL葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶),以了解和控制样品采集、存储和分析过程中的污染。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1固相萃取柱的选择

分别考察Oasis HLB 96孔板(60 mg)、Oasis HLB 96孔板(30 mg)和Prime HLB 96孔板(30 mg)的目标物回收率。其中,Prime HLB 96孔板不需要活化即可直接上样,但填料中有BPA残留,需要清洗填料以免产生空白。Prime HLB 96孔板(30 mg)和Oasis HLB 96孔板(30 mg)对BPF和TCS的回收率均不如Oasis HLB 96孔板(60 mg)(如表3所示),其他化合物的回收率没有显著差别。因此,最终选择Oasis HLB 96孔板(60 mg)作为本实验的固相萃取柱。

2.1.2淋洗条件的选择

本研究考察了甲醇、乙腈等常用有机溶剂对淋洗效果的影响。结果表明,当使用30%(v/v)甲醇水溶液时,BPS、BPF和BPA损失比较严重,而使用30%(v/v)乙腈水溶液时,各目标物的损失最小且洗脱液的基质干扰效应也最小。这可能是因为甲醇的极性强于乙腈,目标物在甲醇中的溶解性更好,洗脱过程中更易损失。在此基础上比较了不同体积分数的乙腈水溶液对淋洗效果的影响。结果发现,在使用30%乙腈作为淋洗液的时候,总体的回收率好,基质干扰效应最小。因此,选择30%乙腈作为本实验的淋洗液。

2.1.3过程空白的考察

BPA广泛应用于生产生活的各个领域,在各种环境介质中均普遍存在,因此,实验过程中采用的各种试剂、耗材,甚至是超纯水和MS级的水中都有可能检出,很难完全避免BPA检测过程中的过程空白,只能尽量降低。本实验对容器、试剂、耗材、仪器和实验残留等方面进行空白测定。结果显示,空白主要来源于试剂、耗材及实验残留。其中,实验过程中使用的乙酸铵缓冲溶液经常能够检出BPA并不可避免,通过使用MS级试剂能够有效降低空白值。每批次使用的离心管和移液枪头需进行空白值评估,无目标物检出方可进行使用。在长期测定的环境中,容易产生目标物残留,因此在实验后对装置和环境进行及时清洗非常重要。每次实验应控制实验过程空白,实验过程空白应低于方法检出限方可使用实验测定数据。

实验比较了相同条件下,使用96孔板和固相萃取小柱进行固相萃取时产生的空白值大小。由于96孔板使用的溶剂量更少,BPA的空白值低于0.05 μg/L, BPS的空白值低于0.004 μg/L,均低于使用固相萃取小柱所引入的过程空白(BPA: 0.2 μg/L; BPS: 0.006 μg/L),说明96孔板不仅能够高通量处理样品,还可以有效降低过程空白的引入。

图 1 实际尿样中BPA m/z 227/212离子对的色谱图Fig. 1 Chromatogram of m/z 227/212 channel of BPA in a real urine sample

图 2 8种环境酚类化合物的色谱图Fig. 2 Chromatograms of the eight environmental phenols

2.2 仪器条件的优化

2.2.1分析柱的选择

对比了Acquity UPLC HSS T3柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)和Acquity BEH C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)对样品中目标物的分离效果。结果表明,使用T3色谱柱时,不仅目标物的峰形不好,而且在实际样品分析时,在BPA的227/212离子对色谱目标峰位置存在干扰峰,使用C18色谱柱时,目标峰和干扰峰的分离效果则更好(见图1)。因此,最终选择C18色谱柱作为本研究的分析柱。

2.2.2色谱条件的选择

本研究比较了甲醇和乙腈作为有机流动相时各目标物的分离效果和峰形。结果显示,二者的分离效果相当,但当使用水和乙腈作为流动相时,各目标物的峰形好,拖尾现象更少,因此采用水和乙腈作为流动相。

比较了以50%水相、60%水相、70%水相和80%水相作为初始流动相时,各目标物的分离效果,并以质控样NIST SRM 3672评价BPA和TCS的定量准确性。研究发现,使用80%水相为初始流动相时能更好地分离双酚A的目标峰和干扰峰,测定结果更准确。使用高比例的水相还能够清洗样品中盐类的干扰,减少质谱污染,降低基质效应。另外,TCBPA、TBBPA和TCS的出峰时间比较接近,水相比例高也有助于提高这3个目标物的分离度,增加各目标物的扫描时间,提高响应强度。在80%水相作为初始流动相时8种环境酚类目标物的色谱图见图2。

2.3 样品基质效应

由于无法获得不含此8种环境酚类化合物的实际尿样基质,本方法用人工尿样代替实际尿样,用于评估计算绝对基质效应。分别用人工尿样和甲醇溶液配制两条标准曲线(不含内标),人工尿样配制的标准曲线进行前处理,与甲醇标准曲线共同上机测定,根据文献[25,26]方法对绝对基质效应进行计算评估。结果显示,BPA、BPF、BPS、BPB和BPAF的|ME|范围为3.47%～15.32%,为弱基质效应,不需要采取补偿措施;TCBPA的|ME|为49.58%,为中等程度基质效应;TBBPA和TCS的|ME|分别为71.99%和86.93%,为强基质效应,中等基质效应和强基质效应均需采取措施补偿。因此,本方法采用同位素内标法抵消基质效应。通过考察用人工尿样和甲醇溶液配制的两条标准曲线(含内标),再次评估绝对基质效应,8种环境酚类化合物的|ME|范围为1.51%～17.27%,说明TCBPA、TBBPA和TCS的基质效应得到了有效补偿。

选取6份不同来源的实际尿样,经上述方法前处理后,得到6份实际尿样基质。分别取490 μL实际尿样基质,加入10 μL 100 μg/L的混合内标。计算这8种内标的峰面积的RSD,用于评估相对基质效应[25,27]。这8种化合物在不同来源的尿样基质中的质谱响应稳定,内标峰面积的RSD分别为4.35%(BPA)、7.83%(BPF)、8.07%(TCBPA)、9.06%(TBBPA)、3.63%(BPS)、5.50%(BPAF)、4.12%(BPB)和5.32%(TCS),说明相对基质效应稳定。基质效应评估的结果说明,在进行定量检测时,可以用标准曲线代替基质匹配工作曲线。

2.4 线性范围和检出限

以目标物峰面积与相应内标峰面积的比值Y对相应浓度X(μg/L)进行线性回归,8种目标化合物在相应的线性范围内相关系数(r)均大于0.999。参照文献[28],根据美国环保署(US EPA)检出限测定程序第2版[29],采用两种方法考察检出限:①对有空白干扰的目标物(BPA、BPS、TCS、TCBPA和BPAF),利用7次过程空白的平均值加3倍标准偏差计算检出限;②对没有空白干扰的目标物,用不含本底的尿样预估方法定量限加标(7次),以3倍标准偏差计算检出限。再以3.3倍检出限计算所有目标物的定量限。考虑到样品中目标物的浓度在前处理时浓缩了2倍,本方法的检出限为0.002～1.09 μg/L,定量限为0.007～3.63 ng/L。线性方程与检出限的结果见表4。

表 4 8种环境酚类化合物的回归方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限

表 5 8种目标化合物在3个水平下的加标回收率及RSD(n=5)

2.5 方法的回收率和精密度

选用接近空白的实际尿样进行加标回收和精密度试验,加标水平分别为2.5、5和25 μg/L,每个水平进行5次平行实验,计算加标回收率和日内精密度。在不同天对实际尿样进行分析测定,以计算日间精密度。结果见表5。

2.6 准确性验证

采用NIST SRM 3672进一步评价该方法的准确性。用该方法对SRM 3672进行检测,与其认证的2种物质的浓度进行比较。认证含量通过将分析证书中的含量(μg/kg)通过尿密度(1.019 g/mL)转换成质量浓度(μg/L)。

如表6所示,该方法对BPA和TCS的检测结果与认证的浓度一致,进一步验证了该方法的准确性。

表 6 SRM 3672平均测定含量与认证含量(n=6)Table 6 Average measured contents and certified contents of SRM 3672 (n=6)CompoundContents/(μg/L)This methodNIST certifiedBPA2.753.11TCS17.818.0 NIST: National Institute of Standard and Technology.

2.7 实际样品的检测

采用本方法对北京市2019-2020年采集的64份尿样进行检测分析,结果(见表7)表明,本批尿样除BPB和BPAF未检出外,其余均有检出,BPA的检出率最高,为100%。在几何平均数(GM)的计算中,低于LOD的值均用LOD/2值代替。测定结果显示,人尿中BPA和TCS的含量相对较高,中位值分别为0.69和1.44 μg/L。BPS的检出率为96.9%,中位数为0.086 μg/L。其他酚类化合物的存在水平均较低。以上结果表明,北京市居民存在普遍的环境酚类化合物暴露,值得关注。