高效液相色谱-串联质谱法检测婴幼儿血清中4种双酚类环境激素残留

刘 芳, 孟桃于, 陈 练, 吴雅君, 熊 顺, 丁 利

(1. 长沙理工大学化学与食品工程学院, 湖南 长沙 410014; 2. 长沙和合医学检验实验室有限公司, 湖南 长沙 410000; 3. 长沙海关技术中心, 湖南 长沙 410004)

双酚A(BPA)是重要的有机化工原料,在工业上双酚A被用来合成聚碳酸酯(PC)和环氧树脂等材料,常被用于制造塑料(奶)瓶、幼儿用吸口杯、食品和饮料(奶粉)罐内侧涂层。越来越多的证据表明,微量甚至痕量的双酚A也会对人体造成潜在威胁,对生物体的生殖遗传与生长发育[1]、免疫系统[2]、神经系统[3]等均会产生不利影响。BPA一方面会通过内分泌系统来干扰影响机体的正常激素水平[4],另一方面还可通过不同的受体途径产生不同的生物学效应。研究表明,在人血清、母乳、尿液中均检测到双酚A[5-9],考虑到BPA对人体健康的威胁,许多国家提出了禁止生产或销售含有BPA奶瓶的立法[10-12]。作为BPA类似物,双酚S(BPS)、双酚F(BPF)和双酚B(BPB)已逐渐被用作塑料制造中BPA的替代品,但是部分研究表明,与BPA本身相比,这些BPA类似物显示出与BPA相似的毒性或更严重的有害作用[13]。

目前,国内外已报道双酚类化合物,针对双酚A的检测方法主要包括荧光分析法[14]、气相色谱法(GC)[15]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[16]、液相色谱法(LC)[17]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[18]、酶联免疫法[19]等。但这些方法主要是对食品、尿液中双酚类环境激素含量的测定。对于血清中双酚类环境激素含量测定的报道较少,尤其对于婴幼儿血清样本中双酚类环境激素的报道几乎没有。此外,双酚类化合物的前处理常采用酶解[20]、固相萃取[21-23]等前处理方法,对于大样本分析存在操作烦琐、成本昂贵的问题。

本研究以甲基叔丁基醚(MTBE)为提取溶剂,采用液液萃取方法进行样品前处理,建立了高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)同时检测血清中BPA、BPB、BPF、BPS的简便快速、特异性强、灵敏度高的方法,并对150例婴幼儿血清样本中双酚类化合物含量进行分析比较。

1 实验方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱仪(AB4500,美国AB SCIEX公司);电子分析天平(MS106DU,瑞士Mettler Toledo公司);高速冷冻离心机(TGL-16M,湖南迈克尔仪器有限公司);超声波振荡器(KQ2200DE,昆山超声仪器有限公司);氮吹仪(MD-200-2,杭州奥盛仪器有限公司);多管涡旋混合仪(LPD2500,北京莱普特科学仪器有限公司)；移液器(德国Eppendorf公司)。

双酚A、双酚B、双酚F、双酚S标准品均购于德国Dr. Ehrenstorfer公司;色谱纯甲醇、乙腈均购于德国Merck公司;色谱纯MTBE购于美国Tedia公司;分析纯丙酮购于中国国药集团化学试剂有限公司;乙酸铵购于德国Sigma公司,超纯水购于中国屈臣氏集团有限公司。

以湖南省人民医院、湖南省旺旺医院、益阳市妇幼保健院、湘潭市妇幼保健院4家医院的婴幼儿为研究对象,共收集150例血清样本。研究对象家属已签署知情同意书。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取10 mg BPA、BPB、BPF、BPS标准品,置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容,配制成1 g/L的标准储备液,于4 ℃保存。

用甲醇将标准储备液配制成BPA、BPB、BPF、BPS质量浓度分别为10 mg/L的中间标准溶液,于4 ℃保存。

用甲醇将BPA、BPB、BPS中间标准溶液配制成0.25、1、5、10、25、50、100 μg/L系列混合标准工作液,将BPF中间标准溶液配制成1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L系列混合标准工作液，现用现配。

1.3 样品采集及前处理

取清晨空腹状态下婴幼儿血清样本约3 mL,分离得血清1～2 mL,于-20 ℃冰箱保存。

使用前先将血清样本从-20 ℃冰箱中取出,室温下置于混匀器上溶解均匀。用移液器精确吸取100 μL血清样本,置于1.5 mL离心管中,加入400 μL MTBE,振荡5 min,于40 ℃超声提取15 min,取出混合液于4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min,取320 μL上层液于干净的1.5 mL离心管中,室温下氮气吹干,然后加入100 μL甲醇复溶,供HPLC-MS/MS进样分析。

1.4 色谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱温:40 ℃;流速:0.2 mL/min;流动相:A为超纯水,B为含0.5 mmol/L乙酸铵的甲醇溶液。梯度洗脱程序:0～0.5 min, 10%B; 0.5～1.0 min, 10%B～60%B; 1.0～5.0 min, 60%B～100%B; 5.0～6.5 min, 100%B; 6.5～6.6 min, 100%B～10%B; 6.6～8.5 min, 10%B;进样量:5 μL。

1.5 质谱条件

离子源:电喷雾电离(ESI)源;扫描方式:负离子扫描;离子源温度(TEM): 450 ℃;雾化气(Gas1)压力:0.34 MPa;辅助气(Gas2)压力:0.34 MPa;离子喷雾电压(IS): -4 500 V;气帘气(CUR)压力:0.24 MPa;检测方式:多反应监测(MRM)模式。4种双酚类环境激素在负离子模式下的质谱分析参数见表1。

表 1 4种双酚类环境激素的质谱参数

2 结果与讨论

2.1 色谱条件优化

考察了在甲醇-水、甲醇(含0.5 mmol/L乙酸铵)-水、甲醇(含1.0 mmol/L乙酸铵)-水、甲醇(含1.5 mmol/L乙酸铵)-水、甲醇(含2.5 mmol/L乙酸铵)-水、甲醇(含0.5 mmol/L乙酸铵)-水(含0.1%甲酸)流动相条件下4种双酚类环境激素的色谱分离效果。实验结果显示,以纯水为水相、纯甲醇为有机相时,BPB、BPF、BPS的响应较低;以纯水为水相,有机相甲醇中添加0.5 mmol/L的乙酸铵时,BPB、BPF、BPS的响应值显著增加,随着乙酸铵浓度的增加,响应值无明显改变;以水(含0.1%甲酸)为水相、甲醇(含0.5 mmol/L乙酸铵)为有机相时,BPA、BPB、BPF、BPS的响应均受到抑制。因此选用甲醇(含0.5 mmol/L乙酸铵)-水为流动相,在MRM模式下BPA、BPB、BPF、BPS混合标准溶液(10 μg/L)的总离子流色谱图见图1,BPA、BPB、BPF、BPS峰形均尖锐对称。

图 1 4种双酚类环境激素(10 μg/L)混合标准溶液的色谱图Fig. 1 Chromatograms of the four bisphenol environmental hormones (10 μg/L) in mixed standard solution

2.2 基质效应

基质是样品中除分析物以外的组分,常对分析物的分析有显著干扰,并影响分析结果的准确性,这些影响和干扰被称为基质效应(ME)[24]。LC-MS/MS中的基质效应由分析物的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致,表现为离子增强或抑制作用。本研究以空白基质标准溶液中目标化合物的峰面积(A)与纯溶液标准溶液中的峰面积(B)比值来计算ME值,即ME=A/B×100%;当ME为85%～115%时,基质效应不明显;当ME>115%时,为基质增强效应;当ME<85%时,为基质抑制效应[25]。结果表明,BPA、BPB、BPF、BPS的基质效应值分别为95.80%、88.98%、108.06%和112.45%; 4种双酚类化合物的ME值均在85%～115%之间,说明基质效应影响较小,因此样品可直接采用纯甲醇溶液配制标准工作溶液进行定量分析。

2.3 前处理条件的优化

2.3.1提取溶剂的选择

双酚类物质的结构中均含两个及两个以上的苯环,易溶于乙腈、丙酮、甲醇等有机溶剂[26]。为选择合适的提取溶剂,本研究考察了甲醇、乙腈、丙酮、MTBE及乙醇5种溶剂对血清中4种双酚类环境激素提取效率的影响(见图2)。可以看出,在提取时间、提取溶剂体积相同的情况下,MTBE的提取效率最高,因此选取MTBE为最佳提取溶剂。

图 2 提取溶剂对血清中4种双酚类环境激素提取效率的影响Fig. 2 Effect of extraction solvents the extraction efficiencies of the four bisphenol environmental hormones in serum MTBE: methyl tert-butyl ether.

2.3.2提取溶剂体积的选择

前处理过程中,提取溶剂的体积对提取效率有很大影响,因此本研究考察了不同提取溶剂体积(100、200、300、400、500 μL)对血清中4种双酚类环境激素提取效率的影响(见图3)。当提取溶剂体积为100 μL时,BPA、BPS的提取效率较低;随着提取溶剂体积的增加,BPA、BPS的提取效率逐渐增加;但当提取溶剂体积大于400 μL时,提取效率变化较小。综合考虑提取效率和成本,提取溶剂体积选择400 μL。

图 3 提取溶剂体积对血清中4种双酚类环境激素提取效率的影响Fig. 3 Effect of extraction solvent volumes on the extraction efficiencies of the four bisphenol environmental hormones in serum

2.3.3提取时间的选择

图 4 提取时间对血清中4种双酚类环境激素提取效率的影响Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction efficiencies of the four bisphenol environmental hormones in serum

考察了不同提取时间(5、15、25、35、45 min)对血清中4种双酚类环境激素提取效率的影响(见图4)。由图可知,提取时间为5 min时,BPA的提取效率较低;随着提取时间的增加,提取效率呈现递增的趋势;在15 min后,增加幅度较小,本着节约时间的原则,本研究选取15 min为最佳提取时间。

2.4 标准曲线和检出限

按1.2节标准溶液的配制方法,将BPA、BPB、BPS用甲醇配制成质量浓度为0.25、1、5、10、25、50、100 μg/L的系列标准溶液,BPS用甲醇配制成质量浓度为1、2.5、5、10、25、50、100 μg/L的系列标准溶液。以目标物峰面积(y)对质量浓度(x, μg/L)绘制标准曲线,4种目标化合物在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数(r2)为0.992 9～0.995 9(见表2)。定量限和检出限分别指S/N=10、S/N=3时目标化合物的浓度,4种目标化合物的定量限分别为0.25、0.25、1.00、0.25 μg/L,检出限分别为0.05、0.05、0.5、0.05 μg/L。

表 2 4种双酚类环境激素的线性方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

表 3 4种双酚类环境激素的加标回收率及精密度(n=3)

2.5 回收率和精密度

为了验证方法的准确性和重复性,在100 μL空白血清样本中,加入适量混合标准溶液，进行3个水平(5、20、100 μg/L)的加标回收试验,每个水平进行6次重复实验,连续3 d重复操作,实验结果见表3。4种双酚类环境激素的平均加标回收率为84.56%～104.43%,日内、日间相对标准偏差均小于10%,证明该方法有较好的准确性和重复性。

2.6 实际样本分析

将血清样本按年龄段分成5个组,每组30例,每个年龄段根据男女性别分成2组,每组15例。按照上述方法测定血清中BPA、BPB、BPF、BPS的含量。

由表4可知,BPA检出含量为0.25～53.70 μg/L,在男童、女童血清中的检出率分别为90.67%和89.33%,其中,0～6月组、6～12月组婴幼儿血清中BPA含量远远高于1～2岁组、3～4岁组、5岁及5岁以上组;BPF检出含量为1.03～2.67 μg/L,在男童、女童血清中的检出率分别为6.67%和1.33%; BPS检出含量为0.28～1.71 μg/L,在男童、女童血清中的检出率分别为5.33%和16.00%; BPB在该150例婴幼儿血清中均未检出。结果表明,婴幼儿血清中BPA的检出率和检出含量远高于BPB、BPF、BPS,分析其原因可能是BPA较其他双酚类环境激素更为普遍的存在于各种塑料制品中,儿童在日常生活中需频繁使用塑料水杯[27]、奶瓶[28-30]、塑料玩具[31]等,增加了BPA进入体内的可能性;奶粉中含有少量BPA[32],婴幼儿通过饮用奶粉[32]、牛奶[33]摄取了一定量的BPA;生活饮用水[34]、食品包装材料[35]等含有少量双酚A。

表 4 150例婴幼儿血清中4种双酚类环境激素的检测结果

3 结论

本研究通过对样品前处理条件的优化,建立了高效液相色谱-串联质谱同时测定4种双酚类环境激素的方法,该方法前处理简单,检测限低,线性范围宽,灵敏度高,精密度好,适用于血清样本中4种双酚类环境激素的检测。实验结果表明,婴幼儿在日常生活中易接触到含BPA的食品、食品接触材料和玩具等。通过本研究初步了解到双酚类环境激素对人体产生的危害,加强了对婴幼儿食品、日用品监管的认知,为预防双酚类环境激素危害提供了科学依据。