猪饲料、猪尿、猪肉中β 受体激动剂常见检测方法

2020-11-02林文秀

今日畜牧兽医 2020年9期

宋瑞，杨洁，苏霞，赵博，林文秀

（1.石家庄市畜产品质量监测中心 050000；2.石家庄市农业行政综合执法支队 050000）

β 受体激动剂是最常见的一类瘦肉精。初始被用于治疗哮喘患者，后期因副作用大而被弃用。80 年代有学者发现其能促进蛋白质合成提高猪瘦肉比率，应用广泛，但是随着人们对食品安全认识的提高，发现β 受体激动剂很容易在猪内脏器官里蓄积残留。人们过量食用此类肉品，会出现中毒症状。因此，对β 受体激动剂进行严把关，深检测尤为重要。

1 猪饲料中β 受体激动剂检测方法

2008 年黄士新、沈富林、曹莹等专家对饲料中β 受体激动剂的检测提出了液相色谱串联质谱法。该方法的原理是将饲料磨碎后，使用提取液位盐酸甲醇混合溶液，使用乙酸铅沉淀蛋白，通过固相萃取小柱净化，净化后收集的液体旋转蒸发蒸干，使用0.2%甲酸水溶液溶解，供液相色谱串联质谱仪进行检测，外标法定量。具体实验方法是于50mL 离心管中称取2g 饲料试样，加入19mL 盐酸甲醇提取液和1mL 饱和醋酸铅溶液，涡旋混合均匀，充分振荡20min，然后于7000r/min 离心10min，上清液转移至另一离心管中。选用混合型阳离子交换柱，依次用3mL 甲醇和3mL 水活化，取转移出的上清液5mL 过柱，而后依次使用2mL 水、2mL 甲醇淋洗，带全部淋洗液流出，抽干2min，用5%氨水甲醇溶液5mL 洗脱，收集洗脱液并使用旋转蒸发仪旋蒸至干，用1mL 0.2%甲酸水溶液溶解，0.22μm 有机滤膜过滤后上机测定。该方法在0.05 mg/kg 至1mg/kg 浓度范围内的添加回收率为80%土20%。

2 猪尿中β 受体激动剂检测方法

饲喂β 受体激动剂的猪只，在屠宰前，通常采用检测猪尿中β 受体激动剂的方式，来观测猪只体内是否含β 受体激动剂。针对猪尿中β 受体激动剂的检测王树槐、孙雷、刘琪、汪霞4 位专家研究出了非常科学的检测方法，液相色谱串联质谱法检测猪尿中β 受体激动剂。该方法的主要原理是通过两种酶酶解猪尿试样中的β 受体激动剂残留物，使其发生反应形成络合物，离心，取上清液，通过调节pH 值沉淀蛋白，增加β 受体激动剂的溶解性，使用异丙醇乙酸乙酯混合溶液进行彻底提取，使用固相萃取柱进行净化，浓缩后过滤膜用高效液相色谱串联质谱法测定，同位素内标法定量。具体实验方法为：混合均匀试样，在50mL 离心管内移取5mL 尿样，加入0.5mL 2mol/L 的乙酸铵缓冲液(于100mL 容量瓶中称取15.4g 乙酸铵，加水溶解至刻度，转移至广口瓶中，用乙酸调pH 至5.2)，再加入40μL 盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，两种酶缺一不可，涡旋混匀，于37℃下避光水浴振荡16h。酶解后，配制内标物浓度为100ng/mL，而后在待测样品中添加100μL，涡旋混匀，使用高速离心机10000r/min 高速离心10min，另置50mL 离心管，转移上层清液至其中，配制5mol/L的NaOH 溶液，后调节pH 至9.8，加入10mL 异丙醇乙酸乙酯混合溶液(比例为异丙醇：乙酸乙酯=6：4)，再加入2g 固体氯化钠饱和水相，涡旋混匀，振摇10min，使用高速离心机10000r/min 离心10min，将上清液倒入50mL 旋蒸瓶内，使用10mL 异丙醇乙酸乙酯混合溶液(比例为异丙醇：乙酸乙酯=6∶4)重复提取一次，使用高速离心机10000r/min 离心10min，上清液倒入上述50mL 旋蒸瓶内，50℃下旋转蒸干，用5mL2mol/L 的乙酸铵溶液(pH=5.2)溶解。使用MCX 柱为固相萃取柱，依次用3mL 甲醇、3mL 水活化，而后将上述溶解液全部过柱，依次用3mL 水、3mL2%的甲酸水溶液、3mL 甲醇淋洗，待淋洗液全部过柱后，空气抽干，用5mL5%的氨水甲醇溶液洗脱；洗脱液在50℃下吹干。吹干后的残余物用1mL 甲醇0.1%甲酸/水(甲醇：0.1%甲酸/水=5 ∶95)溶解，过滤膜后供高效液相色谱-串联质谱法测定。该方法的检测限为0.3ng/mL、定量限为0.5ng/mL。在0.5ng/mL 至2ng/mL 添加浓度的回收率为60%至120%。该方法的批内相对标准偏差＜20%，批间相对标准偏差＜20%。

3 猪肉中β 受体激动剂检测方法

对于动物源性食品中β 受体激动剂检测方法。王树槐、孙雷、朱永林、张骊、汪霞5 位专家提出了科学合理的液相色谱串联质谱法检测动物源性食品中β 受体激动剂。该方法的原理是先酶解猪肉试料中的β 受体激动剂残留物，使用高氯酸调pH 后沉淀蛋白，经高速离心，移取上清液，调节pH 值，分别使用乙酸乙酯和叔丁基甲醇提取，使用固相萃取柱净化，经液相色谱-串联质谱法测定。具体试验方法是：准确称取2g 猪肉样品于50mL离心管内，加入8.0mL 0.2moL/L 乙酸铵溶液(称取15.4g 乙酸铵，将其溶解于1000mL 水中，用适量乙酸调pH 至5.2)，再加入盐酸葡萄糖醛昔酶/芳基硫酸酯酶40μL，涡旋混匀，于37℃下避光水浴振荡16h。酶解完成后，拿出离心管放置至室温，涡旋混匀，使用高速离心机10000r/min 高速离心10min，另备50mL 离心管，将上清液倾到于此，而后加入5mL 0.1moL/L 高氯酸溶液，涡旋混匀，用高氯酸调pH 至1.0，使用高速离心机10000r/min 离心10min 后，移取上清液转移至另备50mL 离心管内。用10moL/LNaOH 溶液调pH 至9.5，加入乙酸乙酯15mL，涡旋混匀，振荡10min，5000r/min 离心5min，取出上层有机相至另一50mL 离心管内。再在下层水相中加入叔丁基甲醍10mL，涡旋混匀，并振荡10min，10000r/min 离心5min，合并有机相，50℃下氮气吹干，用2%甲酸溶液5mL 溶解，备用。使用MCX 固相萃取柱为净化柱依次用3mL 甲醇、3mL 水、3mL2%甲酸溶液活化，取上述备用液全部过柱，再依次用3mL2%甲酸溶液、3mL 甲醇淋洗，待淋洗液全部流出，空气抽干，使用2.5mL 3%氨水甲醇溶液洗脱，将洗脱液在50℃下用氮气吹干。残余物用甲醇0.1%甲酸溶液(甲醇0.1%甲酸溶液=10 +：90，V/V)1mL 溶解，涡旋混匀，15000r/min 高速离心10min，取上清液适量，供液相色谱-串联质谱仪测定。该方法检测限为0.25μg/kg，定量限为0.5μg/kg。本方法在0.5μg/kg 至2μg/kg 添加浓度范围内，用空白添加标准校正，其回收率范围为70%至120%。本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。

4 液相色谱串联质谱仪仪器操作条件

以上猪饲料、猪尿、猪肉中β 受体激动剂检测方法，由于样品不同，前处理操作各不相同，但是均为液相色谱串联质谱法，使用的仪器设备相同，因此仪器的使用条件相同。以下为我单位使用液相色谱串联质谱仪仪器条件：仪器型号为AB Sciex 5500；流动相为A 相：0.1%甲酸水，B 相：0.1%甲酸乙腈；色谱柱为Agilent Eclipse C18 柱，规格：100mm×2.1mm，粒径3.5μm；柱温为30℃；流速为0.3mL/min；进样量为10μL。