不同加工方法对覆盆子活性成分影响初探*

蔡妙婷 戴迪 袁源见 郑明敏 杨海燕 王小青 李晶

（江西省中医药研究院 南昌330046）

覆盆子是蔷薇科植物掌叶覆盆子RubuschingiiHu的干燥果实，具有益肾、固精、缩尿、养肝明目的功效[1]。现代研究表明，覆盆子中含有黄酮、萜类等化合物[2～4]，具有较强的抗氧化、保肝作用[5～7]。《中国药典》2015版记载含覆盆子的复方制剂多达十种，并将鞣花酸及山柰酚-3-0-芸香糖苷作为覆盆子质量控制的重要指标，规定按干燥品计算，含鞣花酸不得少于0.20%，含山柰酚-3-0-芸香糖苷不得少于0.03%。中药材产地加工干燥方法的不同，往往会对药材的药性产生影响，《中国药典》2015 版记载覆盆子的加工方式为置沸水中略烫或略蒸，取出，干燥。目前，覆盆子的加工方法主要采用直接烘干的方式，龟鹿补肾丸中覆盆子则需蒸制，而不同加工方法对覆盆子中活性成分会产生何种影响，还未见文献报道。故而本研究将采收的覆盆子分别用蒸法、煮法及直接烘干法进行加工，以鞣花酸及山柰酚-3-0-芸香糖苷的含量作为评价指标，初步探讨不同加工方法对覆盆子中活性成分的影响，为今后系统性研究覆盆子合理采收加工方法，优化覆盆子产地加工技术，提高和控制覆盆子药材质量奠定了研究基础。现报道如下：

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent1260 高效液相色谱仪（包括四元泵溶剂系统、在线脱气机、自动进样器、二极管阵列检测器，Agilent 公司）；MS105Du 十万分之一天平（METTLER TOLEDO 公司）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）；103B 型高速中药粉碎机（浙江省瑞安市永历制药机械有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9101-2SA（上海三发科学仪器有限公司）。

1.2 材料 对照品鞣花酸（纯度：89.3%，批号：111959-201602）、山柰酚-3-0- 芸香糖苷（纯度：90.8%，批号：112007-201602）均购自中国食品药品检定研究院，甲醇、乙腈为色谱纯（美国Tedia 公司），磷酸、无水乙醇为分析纯，水为纯净水。覆盆子新鲜药材于2019 年4 月采自江西天之海药业股份有限公司德兴覆盆子种植基地，经江西省中医药研究院虞金宝研究员鉴定为蔷薇科植物掌叶覆盆子（R.chingii）的未成熟果实。

2 方法与结果

2.1 样品加工干燥 直接烘干法：称取摘除果柄的覆盆子果实200 g，于65℃烘箱中干燥48 h；蒸法：称取摘除果柄的覆盆子果实200 g，单层平铺于蒸锅中，待水沸腾后上锅蒸制5 min，再于65℃烘箱中干燥48 h；煮法：称取摘除果柄的覆盆子果实200 g，于5 倍量沸水中煮1 min 后，捞出，在65℃烘箱中干燥48 h。

2.2 供试品溶液的制备 分别取上述三种加工样品粉末（过四号筛）约1 g，精密加入70%甲醇50 ml，精密称重，加热回流60 min，放冷，再次精密称重，以70%甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备 精密称取鞣花酸、山柰酚-3-0-芸香糖苷对照品适量，用甲醇溶解并定容，制成浓度分别为鞣花酸0.019 9 mg/ml、山柰酚-3-0-芸香糖苷0.011 3 mg/ml 的对照品溶液。

2.4 色谱条件 色谱柱：Welchrom C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B）；按表1 的条件进行梯度洗脱；检测波长：鞣花酸在254 nm 有最大吸收，山柰酚-3-0-芸香糖苷在344 nm 有最大吸收；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10 μl。对照品和供试品高效液相色谱（HPLC）图见图1～图2。

表1 梯度洗脱条件

图1 波长254 nm 下覆盆子对照品（A）与供试品（B）HPLC 图

图2 波长344 nm 下覆盆子对照品（C）与供试品（D）HPLC 图

2.5 线性关系考察 分别精密吸取鞣花酸、山柰酚-3-0-芸香糖苷对照品溶液1、2、5、10、15、30、50 μl，注入液相色谱仪，按“2.4”项下色谱条件进行操作。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：鞣花酸y=446.77x+934.96（r=0.999 6）、山柰酚-3-0-芸香糖苷y=27.252x+105.14（r=0.999 2），结果表明鞣花酸及山柰酚-3-0- 芸香糖苷分别在0.019 9～0.597 0 μg、0.011 3～0.565 0 μg 范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液，连续进样6 次，每次10 μl，测定峰面积，分别计算鞣花酸及山柰酚-3-0-芸香糖苷的峰面积RSD 为0.76%、2.17%。测定结果表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 称取覆盆子供试品粉末（直接烘干法）6 份，按“2.2”项下方法制备成供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，计算鞣花酸和山柰酚-3-0-芸香糖苷的含量，RSD 分别为0.55%、0.67%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取覆盆子供试品溶液（直接烘干法），按“2.4”项下的色谱条件，分别在制备后0、2、4、6、8、10、12 h 进样测定，记录峰面积，计算得到鞣花酸及山柰酚-3-0- 芸香糖苷峰面积RSD 分别为0.54%、0.67%，表明该供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.9 样品测定 取覆盆子各种加工方法的样品各2份，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.4”项下的色谱条件进样测定，结果蒸法所得覆盆子药材中鞣花酸及山柰酚-3-0-芸香糖苷含量分别为0.085%、0.058%，煮法为0.090%、0.044%，直接烘干法为0.113%、0.058%。色谱图见图3～图4。

图3 波长254 nm 下不同加工方法所得覆盆子样品HPLC 图

图4 波长344 nm 下不同加工方法所得覆盆子样品HPLC 图

3 讨论

研究结果表明，不同加工方法对覆盆子中的鞣花酸及山柰酚-3-0-芸香糖苷两种活性成分含量略有影响，其中鞣花酸含量在直接烘干法样品中最高，煮法次之，蒸法最低。由于鞣花酸常与葡萄糖、阿拉伯糖等缩合形成糖苷，或以鞣质的形式存在[8]，这种含量的改变可能与糖苷或鞣质的水解和鞣质在加热后凝固有关，从而影响了鞣花酸的提取量。而山柰酚-3-0-芸香糖苷在直接烘干法和蒸法中含量相近，煮法中含量最低，这可能与苷类的水解和加工过程中的有效成分溶出有关。从实验结果看，通过改变覆盆子加工干燥方法，可以改变药材中各活性成分的含量，但这种含量的变化，对药材药效的影响还不明确。本研究只是通过测定药典中的两个活性指标的含量变化，从而初步探究了加工方法对含量的影响，但加工方法对活性成分含量的影响机制还需后期进行系统性的研究，以期探明覆盆子各化学成分之间的转化规律，以及含量变化后药理作用的变化。本研究为今后确定覆盆子活性成分，优化覆盆子加工工艺奠定了基础。