毒理学实验教学中3R原则的应用探索*

王取南，赵玲俐，孙美芳，高 蓝，张 程，王 华，张 君，徐德祥

[安徽医科大学公共卫生学院卫生毒理学系(环境毒理学安徽高校省级重点实验室)，安徽 合肥 230032]

毒理学研究主要以体外研究、整体动物实验和人体观察相结合为主要手段。在研究过程中常常会使用大量动物。如何尽可能减少实验动物数量，减少实验动物的痛苦，并充分利用每只动物，是每个毒理实验需要关注的内容。毒理学中的“3R”原则指“优化”(refinement)实验方法和技术，“减少”(reduction)受试动物数量和痛苦和“替代”(replacement)整体动物试验模式。通过3R原则，可明显减少动物的使用量[1]。以“3R”实验为导向设计的实验方法被定义为毒理学替代法。例如，传统的LD50检测方法需要使用大量的动物，以“3R”原则为导向设计的“固定计量法”、急性毒性分级法、上下法等可以使动物使用量大大减少[2]。但是，在本科生实验教学中，“3R”原则还没有真正落实，仍然存在使用实验动物数量过多和动物利用不充分的问题。

1 毒理学实验教学中存在的一些问题及解决路径

在本科毒理学实验教学中，一般开设的实验课程需要用到不少实验动物，如染毒方法、生物材料采集、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和精子畸形试验。除教师示教用小鼠外，每次每位学生至少使用1只小鼠，一般情况还得多准备若干只小鼠备用。

每次课程有其特定的有限教学目的，小鼠也只能发挥较单一的作用。例如“生物材料采集实验”，主要目的是要求学生掌握小鼠脏器的位置和摘取方法，并计算部分脏器的脏器系数；“微核实验”每次都用同样的样品处理小鼠，并且在小鼠剖杀后，只取胸骨，挤出骨髓涂片染色观察，其它脏器不被有效利用；精子畸形实验中，剖杀前35 d给药，剖杀时只使用了附睾尾，处理时间长，利用率低。为防止污染，备用小鼠在课程结束后不能再放回鼠房，通常使用颈椎脱臼处死[3]。

实验课程可以像科研课题那样，选定某特定化学物，针对特定科学问题，合理设计，将一些传统单项实验课程进行合理整合，这样就能通过一次实验课达到传统单项课程多次课的实验教学目的，大大提高教授学生基础毒理实验知识和训练基本实验技能的课程效率，还可以优化实验流程、方法和技术，减少使用动物数量，用生物材料的检测替代整体动物实验，实现“3R”原则。因为是类似科研课题的教学实验设计，还可以引导学生利用专业知识解决实际问题或科学问题，培养学生创新力。

在安徽医科大学公共卫生学院2015级食品质量与安全专业的本科生实验中展开了试点。受试物为邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)。

2 以“3R”原则为导向的实验教学试点

2.1文献检索 DEHP是塑料中含量较高的一种塑化剂，以非共价结合方式存在于塑料中，很容易转移到环境中。生活中，常用的塑料制品如水杯、碗筷和包装袋等都含有DEHP，并能够转移到饮料、饭菜和零食里，进入机体产生毒性作用，属于食品毒理学范畴。为了解DEHP的相关毒性作用，首先布置学生进行相关文献检索和阅读，认识到DEHP有抗雄激素和拟雌激素作用，是环境内分泌干扰物，且具有生殖毒性、发育毒性和致癌作用；然后引导学生针对DEHP的毒性作用特点，分析和提出一些小的科学问题并设计相应的解决方案，进行大学生创新研究设计。

2.2小科学问题的提出和解决方案分析 (1)与非遗传毒性致癌物不同，遗传毒性致癌物通常具有致突变性。DEHP是否有致突变作用？致突变作用是发生在体细胞还是生殖细胞中呢？本科生实验中的“小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验”是用于检测DNA断裂剂和非整倍体诱变剂的致突变性检测方法，可检测外源化学物对体细胞的致突变性；“小鼠精子畸形”实验可以反映雄性生殖毒性，阳性结果还提示受试物可能具有生殖细胞致突变性。(2)DEHP是环境内分泌干扰物，是否会影响动物血清中的性激素水平？可以通过麻醉下经眼内眦取血方法，保留血液样品，制备血清超低温保存备用，后期用ELISA法检测激素水平，获得DEHP影响内分泌的血清学证据。(3)具有内分泌干扰特性的DEHP是否影响组织器官性激素受体表达？小鼠麻醉取血后脱颈处死，摘取各脏器，部分多聚甲醛固定备后期冰冻切片用于性激素受体的免疫组织化学；部分超低温保存，后期匀浆提取蛋白和核酸，用于Western-blotting和RT-qPCR检测性激素受体蛋白和mRNA的表达水平。

2.3实验方法的选择和设计 (1)实验教学项目：课堂教学完成实验动物生物材料的采集、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形制片；课后有兴趣的学生跟随硕士研究生进行ELISA法检测激素水平，激素受体的免疫组化、Western-blotting和RT-qPCR等拓展项目。(2)染毒方法：因为“小鼠精子畸形”实验从给药到剖杀耗时较长，且教学中主要训练学生制片方法，因此依据小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验的急性染毒进行。小鼠禁食后，根据雌雄各半的原则和按体重半随机分组法分为5组，包括阳性对照组，腹腔注射环磷酰胺；阴性对照组，灌胃给予不加DEHP的乳糜制剂；低、中、高剂量组，灌胃给予不同剂量的DEHP乳糜制剂。提前24 h给药1次。(3)实验流程：给药24 h后，称体重，麻醉下经眼内眦取血，常规制备血清，超低温保存备用。完成取血后，脱颈处死小鼠，胸骨骨髓涂片行微核试验，取附睾尾行精子制片备后续染色观察，摘取各脏器称重，部分多聚甲醛固定备用，部分先液氮速冻，后转移到-80 ℃超低温保存备用。

2.4实验结果 传统教学中，实验动物生物材料采集、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠精子畸形是单独开设的三次实验课，试点试验课通过优化实验设计和流程，将它们整合为一次课程，落实了3R原则中的“优化”原则；实验动物数量只需要传统课程需要量的三分之一，节约了三分之二的实验动物，体现了3R原则中“减少”的应用(表1)；部分同学基于试点试验，申请DEHP环境内分泌干扰作用机制的创新研究项目，直接利用保存的生物材料样品，代替整体动物实验，实现了3R原则中“替代”的应用。

表1 传统实验与试点实验的对比

通过本次实验，在完成既定教学任务基础上，学生初步了解了科学研究的一般过程，了解了毒理学中实验项目和方法的系统设计原则，懂得了阳性对照和阴性对照的设计意义。学生后续完成了小鼠精子染色观察，部分学生跟随研究生进行了后续的形态学实验(免疫组化)和分子生物学实验，培养了学生的科研兴趣，激发了学生的科研热情，部分学生组队申请了大学生创新研究项目。

3 总结与展望

本次试点，实验动物的使用从单纯的基础学习，转化为在完成基础知识学习的同时，实现小的科学研究。这种转化不仅充分利用实验动物，贯彻了“3R”原则，还提升了学生们的创新科学思维，为他们将来可能经历的科研道路做了铺垫。

在毒理学实验中还有一些可以转化为基础学习与科学研究共同进行的实验。基础学习为科学研究提供了实验操作的基础，而科学研究提升了实验操作的价值。系统化的操作过程，为学生在未来参与科研课题时开拓了视野[4]。这些实验如果都能转化为解决某个科学问题的手段，那么学生能真正从简单接受知识和实验技能培训的被动学习，转变为主动寻找科学问题、积极参与实验设计的主动学习状态，有利于激发和培养学生运用课堂所学，思考和解决现实问题的热情和能力。

针对学科特定的科学问题，优化实验设计，将传统单项实验课程整合为综合性、设计性和创新性实验，或可称为实验教学的科研化。这种实验教学课程科研化改革，必将为大学专业课程实验教学带来更多的生机和活力。