抑制曲霉菌的乳酸菌分离及鉴定

李利红 刘海荣 贺莹

摘要：以萝卜、酸黄瓜和泡椒3种市售腌制酱菜为试验材料，采用溶鈣圈法分离纯化疑似乳酸菌，采用革兰氏染色、过氧化氢酶和双层平板等方法筛选抑菌性菌株，采用生化鉴定和糖发酵鉴定其种属。结果表明：从3份酱菜样品中分离到40株疑似乳酸菌，筛选出3株（S1、S6、P5）对黑曲霉菌具有抑制性，2株（S6、S7）对黄曲霉具有抑制性，发现菌株S1、S7为发酵乳杆菌，菌株S6、P3为植物乳杆菌。

关键词：乳酸菌;曲霉菌;抑菌;分离鉴定

中图分类号 S816.3 文献标识码 A 文章编号 1007-7731 （2020） 16-0040-03

霉菌是一种能形成分枝菌丝的真菌，是对一类丝状真菌的统称。黄曲霉素是一种致癌物，致癌力居首位，是目前已知最强致癌物之一，在食品中污染非常广泛[1]。黑曲霉可以分泌葡萄糖苷酶等蛋白，也可吸附重金属离子，对动物肾脏造成不可逆的致死毒害，并可导致孕妇流产甚至死亡[2]。有研究表明，乳酸菌有抑制杂菌作用，但是从发酵型食品中筛选具有抑菌菌株的研究较少。乳制品中常见的菌种有保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌和嗜热链球菌[3-4]，而发酵类蔬菜中常见的菌种有植物乳杆菌和发酵乳杆菌等[5]。每天摄入定量的活菌乳酸菌，可有效地预防和缓解微量元素引发疾病。更为重要的是，乳酸菌为兼性厌氧菌，缺氧环境利于其快速生长，间接对致病杂囷形成抑制，有效控制肠道内菌种，减少有害菌引发疾病[6-7]。目前，化学防腐剂的应用有效地控制了腐败变质，但化学防腐剂具有副作用，如致癌等，国家对有害食品添加剂发布禁令，限制或限量使用。因此，筛选广谱高抑菌活性的乳酸菌，且应用于食品的生产及保存，具有重要的实践意义[8-9]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 分离样品 市售腌制酱菜酸黄瓜、萝卜、泡椒。

1.1.2 指示菌 标准霉菌：黑曲霉ATCC16404（上海鲁微科技有限公司）;黄曲霉AS3.3950（上海鲁微科技有限公司）。

1.1.3 培养基 MRS培养基、PDA培养基，实验室自配[10-11]。

1.1.4 主要试剂 革兰氏染色液：上海海博生物;对二甲氨基甲醛：天津致远试剂有限公司;明胶：上海制成化学试剂有限公司;30%过氧化氢：天津风船化学试剂科技有限公司。

1.1.5 主要仪器 高压蒸汽灭菌锅（LDZX-50KBS）：上海申安医疗器械厂;超净工作台（ZHJHC1112B）：上海智城分析仪器制造公司;恒温培养箱（SPX-250）：上海跃进医疗器械有限公司;生物显微镜（SMART）：重庆奥特;涡旋振荡器（MS3 basic）： IKA;电子天平（CPA225D）：赛多利斯科学仪器有限公司;电热鼓风干燥箱（BGI-146）：上海博讯实业有限公司;紫外分光光度计（UV-31OOPC）：上海美普达仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 乳酸菌分离 乳酸菌富集：在超净工作台中，用无菌操作方法，取少量酱菜样品于MRS液体培养基，37℃恒温厌氧（放入干燥器中，点燃酒精灯后密闭）培养24h。梯度稀释：将培养液充分震荡，取培养液1 mL，加入含9mL无菌水的干净试管中，则浓度为10-1;充分振荡混匀后，再从10-1稀释液中取1mL加入另一支含9mL无菌水干净试管中，则浓度为10-2;依此类推稀释到10-6，应注意无菌操作，试管和移液枪枪头都应灭菌，且每次更换移液枪枪头。乳酸菌分离：将含3%CaC03的MRS琼脂培养基灭菌冷却至50℃，倾倒入无菌培养皿15mL，待其凝固后，吸取稀释液10-3、10-4、10-5、10-6各0.1 mL于培养基中，涂布均匀，37℃恒温厌氧培养24h，待其长出菌苔后观察，平板菌落数20～20（）[12]。

1.2.2 乳酸菌初步鉴定

1.2.2.1 革兰氏染色鉴定 参见文献[13]。

1.2.2.2 过氧化氢酶活性鉴定 用接种环挑取一环革兰氏染色为阳性（紫色）的菌落到干净载玻片，滴加一滴3 %过氧化氢，产生气泡为阳性，不产生为阴性。过氧化氢酶阴性菌落可初步确定为乳酸菌。

1.2.3 分离菌落纯化 将初步鉴定为乳酸菌的菌株，在MRS琼脂培养基反复划线，得到单个菌落，转接至试管斜面，4℃冷藏保存以备后续实验使用[14]。

1.2.4 抑制霉菌活性的乳酸菌筛选

1.2.4.1 霉菌孢子液制备 取冷藏保存菌种，PDA试管斜面划线活化，28℃恒温培养5d，至大量孢子产生，向试管中加入5mL无菌水，用接种环轻轻刮取，充分振荡，经无菌纱布过滤菌丝残体后倒出。取1mL孢子悬浮液，10倍浓度梯度稀释，取10-2、10-3、10-4各0.1 mL涂布于PDA平板，28℃恒温培养2d，察生长密度，菌落数适宜浓度30～300。

1.2.4.2 抑菌菌株筛选 双层平办法：倒入MRS琼脂培养基作为下层平板，将分离得到的乳酸菌在MRS平板划2条长2cm的平行直线，37℃恒温培养24h，至长出菌苔，再倒入含有霉菌孢子的PDA琼脂培养基作为上层平板，28℃恒温培养2d，以接种霉菌孢子但不接种乳酸菌为空白对照，观察霉菌生长面积，测量计算抑菌率。计算公式如下：

抑菌率（%）=（S-SM1）/（S-SM0）×100 （1）

式中：S为平板总面积，cm2;SM1为试验组霉菌生长面积，cm2; SM0为对照组霉菌生长面积，cm2。

1.2.5 抑菌乳酸菌理化鉴定

1.2.5.1 明胶液化试验 将斜面保藏的菌株2次传代培养后，按照1%的接种量接种于明胶基础培养基中，每个菌株接10支试管，每支以不接种的试管为空白对照。在37℃恒温厌氧培养，每隔2d分别取2支试管和空白组进行观察。先将试管置于冰箱冷冻至空白组凝固，若空白组培养基凝固而试验组培养基不凝同，则为明胶液化阳性，否则为阴性。

1.2.5.2 产生试验 将滤纸剪成约0.5～0.6cm寬的纸条，长度根据试管而定，用80g/L乙酸铅溶液浸润，烘干。将斜面保藏的菌株2次传代培养后，按照1%的接种量接种于硫化氢培养基中，镊子子夹取1 一条乙酸铅纸条，悬挂于接种试管内，下端靠近培养液，以上部分不接触，用棉塞塞紧，37℃恒温厌氧培养48h，在不接种的试管内悬挂纸条作为空白对照。观察纸条是否有黑色物质产生，若有为阳性，否则为阴性。

1.2.5.3 吲哚试验 将斜面保藏的菌株2次传代培养后，按照1%的接种量接种于H2S液体培养基中，并设置空白对照。37℃恒温厌氧培养4d后，沿管壁缓慢加入吲哚试剂数滴，观察分界处若有红色产生，则为阳性，否则为阴性。

1.2.5.4 淀粉水解试验 将斜面保藏的菌株2次传代培养后，用无菌生理盐水稀释105倍，吸取0.1 mL涂布于淀粉培养基上，并设空白对照。37℃恒温厌氧培养2d长出菌苔后，向平板上滴加碘液，观察颜色变化。若空白组明显变蓝，而试验组无明显颜色变化，则为淀粉水解酶阳性，否则为阴性。

1.2.5.5 V-P试验（乙酰甲基甲醇试验）将斜面保藏的菌株2次传代培养后，按照1%的接种量接种于V-P试验培养基中，并设空白对照。37℃恒温厌氧培养24h后，取2mL培养液加入等体积的40%氢氧化钠溶液混匀，再加入1mg肌酸，充分振荡后静置30～60min，观察颜色变化，若颜色变红，则为阳性，否则为阴性。

1.2.5.6 乳酸菌碳水化合物发酵试验 将斜面保存的乳酸菌菌种接种至MRS液体培养基，2次传代培养后，去0.05mL培养液接种至碳水化合物发酵培养基，37℃恒温厌氧培养（表1）。结果判定：阳性结果为培养基中的颜色变黄;弱阳性结果为培养基的颜色部分变黄;阴性结果为颜色不变，与不含糖类的对照管相同。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离结果 根据菌落生长情况，稀释浓度为10-5，选择该浓度进行后续试验。菌落为乳白色，表面光滑，呈圆形，酸黄瓜和泡椒中菌株为杆状，萝卜中菌株为球状。3种样品中的菌落，萝卜中菌株没有溶钙圈，泡椒中有20株，酸黄瓜中有25株。对具溶钙圈菌株进行革兰氏染色，结果共有40株G+、5株G-。再对40株G+菌株进行接触酶试验，结果都为阴性，可初步确定为乳酸菌，分别编号为P1～16，S1～24，转接至试管斜面保存。

2.2 菌株筛选结果 通过观察涂布霉菌孢子的平板菌落数，霉菌孢子悬浮液1 mL稀释100倍，涂布0.1 mL菌落数较为合适。通过双层平办法，结果显示共有3株菌株（S1，S6， P5）对黑曲霉菌抑制效果较显著，2株菌株（S6，S7）对黄曲霉抑制作用较显著，S1对黑曲霉抑菌率为26%，S6对黑曲霉抑菌率为36%，P5对黑曲霉抑菌率为28%，S6对黄曲霉抑菌率为24%，S7对黄曲霉抑菌率为23%。

2.3 生理生化鉴定结果 由表2和表3可知，根据《常见细菌系统鉴定手册》鉴定，菌株S1、S7为发酵乳杆菌，S6、P3为植物乳杆菌。

3 结论

本试验以3份市售酱菜为材料，分离得到45株疑似乳酸菌;经形态学和生理生化鉴定，其中40株菌株初步确定为乳酸菌;以黑曲霉菌和黄曲霉菌为指示菌，采用双层平办法筛选出4株具有抑制霉菌活性菌株;通过生理生化鉴定和糖发酵试验，鉴定菌株分别为发酵乳杆菌和植物乳杆菌。

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[14] 陈祥奎.保证食品安全的抗菌剂[J].中国食品添加剂，1995（03）：16-26.

（责编：张宏民）

基金项目：山西省高等学校科技创新项目（2019L0980）;山西省高等学校教学改革创新项目（J2016114）;吕梁学院大学生创新项目。

作者简介：李利红（1984-），女，山西临县人，研究方向：微生物生理。 *通讯作者

收稿日期：2020-06-30