大鲵MC1R基因的克隆、序列分析与表达研究

邓捷　卫小燕　张晗　马红英　王启军　赵虎　张红星　姜维

摘 要：为研究MC1R在两栖动物体色形成中的作用，试验结合转录组分析和电子克隆技术得到大鲵（Andrias davidianus）MC1R部分cDNA序列并进行了生物信息学分析，采用实时荧光定量法检测了大鲵MC1R基因在皮肤、肝脏等10个组织中的表达情况及4种不同体色大鲵皮肤组织中MC1R基因的表达量。结果表明：得到大鲵MC1R部分cDNA长为295 bp，位于该基因编码区。其与人、小鼠等哺乳动物和鸟类MC1R核苷酸同源性在57%～83%。大鲵MC1R基因与粗皮渍螈的亲缘关系最近。该基因在不同组织中均有表达，以皮肤组织表达量最高。4种不同体色大鲵皮肤组织中，黑色皮肤中MC1R基因表达量高于其他体色。说明大鲵MC1R基因在体色形成过程中可能具有与其他两栖动物不同的调控机制。

关键词：大鲵（Andrias davidianus）;体色;黑色素;黑皮质素受体-1（Melanocortin-1 receptor，MC1R）基因;表达

中图分类号：Q959.9;Q78

两栖类动物体表表现出独特的色彩类型和着色模式，是物种进化和表观遗传学研究的热点问题。两栖动物体色与其真皮层中的三类色素细胞相关：载黑素细胞（melanophores）合成和运输黑色素，产生了褐色-黑色体色[1]，载虹素细胞（iridophores）对光线的反射和散射作用，产生了蓝-绿色体色[2];载黄素细胞（xanthophores）含有蝶啶或类胡萝卜素，产生了黄色的体色。

目前，有关哺乳动物、鸟类和鱼类体色形成的分子遗传机制的研究较多，揭示了围绕黑色素细胞进行的黑色素合成与运输相关分子调控系统。两栖类动物具有独特的体色类型，以往的研究从生理学和行为学上对其体色形成模式进行阐述和分析[3-5]，有关其体色性状下潜在的分子遗传特征的报道较少[6]。黑皮质素受体-1（Melanocortin-1 receptor，MC1R）是动物黑色素合成通路中的限速酶，在载黑素细胞合成黑色素转为合成褐色素过程中起着类似于“开关”的作用[7]。哺乳动物、鸟类、爬行动物MC1R基因突变会引起动物体色（毛色）白化、黄化或者黑化[8-10]。Herczeg等研究成果显示MC1R基因的核苷酸突变与欧洲普通青蛙（Rana temporaria）体色的黑化程度不存在相关性[11]，但欧洲普通青蛙（Rana temporaria）17个地理种群间MC1R基因的多态性存在差异[12]。中国大鲵（Andrias davidianus）是现存体型最大的两栖动物，在其漫长的进化过程中形成了丰富的体色。野生型的大鲵体色为不同深浅的棕-黑色，白化和黑化是两种比较常见的体色变异类型[13]。黑色素合成通路十分保守，因此推测黑皮质素受体-1MC1R）基因及其多态性可能与中国大鲵不同体色的表型相关。

本研究采集了自然色大鲵、白化个体、黑化个体（见封三图1）皮肤组织样，克隆了大鲵MC1R基因部分序列，采用qRT-PCR方法检测并分析其在大鲵10个组织和器官中表达分布和其在上述三种体色个体皮肤组织中表达情况，总结了大鲵MC1R基因表达谱差异，探讨了该基因与大鲵体色白化与黑化之间的关系，初步阐述了大鲵体色形成的分子基础，为两栖动物体色遗传机制研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验大鲵个体来自汉中古生大鲵有限公司，具有渔业行政主管部门颁发的水生野生动物经营利用许可证（（汉）水野经字（2015）23号））。

1.2 主要试剂

Trizol Reagent，购自美国Invitrogen公司;Rnase-free DnaⅠ，购自大连宝生物公司;RevertAid cDNA Synthesize Kit，购自加拿大Fermentas公司;FastStart SYBR Green qPCR Master Mix，购自德国Roche公司。

1.3 主要仪器

液氮生物容器，购自四川金凤;台式超速低温离心机，购自德国Eppendorf公司;去离子水超纯水系统及恒温水浴循环系统，购自美国Thermo公司;紫外分光光度计，购自德国Beckman公司;实时荧光定量PCR仪及凝胶成像系统，购自美国Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 实验动物分组

选取3尾大鲵，取其皮肤、肌肉等10个组织，具体采集的组织部位和方法同姜维等[13]所述。

2.2 RNA提取

取0.2 g不同组织样本，于研磨器中低温研磨至匀浆后，利用Trizol法提取总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取效果，紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度。

2.3 反转录

利用RevertAid cDNA Synthesize Kit进行反转录实验，反应体系：总体积20 μL，其中RNA模板 2 μg，oligoDT 1 μL，5×buffer 2 μL，RNase抑制剂1 μL，10 mM dNTP mix 1 μL，反转录酶1 μL，加DEPC水至20 μL。反应条件：42 ℃，60 min;70 ℃，2 min。-20 ℃保存产物，备用。

2.4 MC1R基因扩增及荧光定量PCR引物设计与合成

以前期实验获得的大鲵皮肤组织转录组文库中MC1R基因序列為参照，使用PrimerQuest（http：//sg.idtdna.com/Primerquest/Home/IndexPrimer）设计MC1R基因荧光定量PCR引物，引物详情见表1。

2.5 MC1R基因序列分析

通过CAP3（http：//biosrv.cab.unina.it/webcap3/）软件完成大鲵MC1R基因序列拼接;FeatureMap3D （http：//www.cbs.dtu.dk/services/FeatureMap3D/）及SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）进行蛋白高级结构域分析;利用ClustalW等将大鲵MC1R基因核苷酸序列与GenBank中的其他物种序列进行同源比对。

2.6 qRT-PCR分析大鲵MC1R和MITF基因的组织特异性表达

采集大鲵肌肉、皮肤、心、肝、脾、肺、胃、胰脏、生殖腺（卵巢/精巢）、腸道组织等不同来源组织cDNA为模板，使用前期设计的荧光定量PCR引物，进行大鲵MC1R基因PCR扩增。反应总体积为20 μL，其中cDNA 1 μL，10 nmol/μL  dNTP 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.75 μL，FastStart SYBR Green qPCR Master Mix （德国Roche） 14.5 μL。反应条件：94 ℃，1 min;40个循环（94 ℃，18 s;62 ℃，18 s;72 ℃，20 s;），85 ℃ 读板。GAPDH作为内参基因，同时以未加模板的反应孔作为空白对照，每个反应重复三次。利用SPSS16.0软件对数据进行分析统计，分别以MC1R/MITF基因的Ct值减掉相应GAPDH的Ct值，得出MC1R/MITF基因的ΔCt，使用Power（2，-ΔΔCt）公式计算MC1R/MITF基因的相对表达量。

2.7 qRT-PCR分析不同体色大鲵MC1R基因的特异性表达

以WT、am、aa、ma等4种差异显著体色大鲵皮肤组织cDNA为模板，利用荧光定量PCR引物，进行MC1R基因PCR扩增。反应体系及条件等同2.6。

3 结果与分析

3.1 RNA提取效果检测

组织样总RNA电泳效果见图2，结果显示28 S条带亮度是18 S的2倍左右，说明提取的总RNA完整性和浓度较好，可用于后续实验。

3.2 MC1R和MITF基因的电子克隆及序列分析

大鲵皮肤组织转录组文库中的ESTs经拼接后得到大鲵MC1R基因cDNA长为295 bp，位于该基因编码区（图3）。

3.3 MC1R基因核苷酸同源性比较及系统进化树构建

使用BioEdit软件的ClustalW程序对大鲵MC1R基因与其他物种的核苷酸序列相似性进行多重比对（图4），结果显示，大鲵与粗皮渍螈（T.granulosa）相似性最高，为83.33%，与西部锦龟（C.picta bellii）的序列相似性在80.14%，与其他脊椎动物的序列同源性介于57%～79.18%之间。采用NJ法构建蛋白系统发育树（图5），结果显示：大鲵与粗皮渍螈进化关系最近，能够聚为一支。

3.4 大鲵MC1R基因组织表达谱差异

实时荧光定量PCR结果显示，大鲵MC1R基因在实验个体的所有组织中均有表达，其中在皮肤组织中mRNA的表达量最高，其次为胰腺、胃、肺、肝脏、肠、脾脏、性腺组织等，在心脏和肌肉组织中表达量最低（图6）。同时发现MC1R基因在不同体色个体的皮肤组织中均有表达（图7），其中在尾部皮肤为黑色（am型）中mRNA的表达量最高，其次为黄色皮肤组织（aa型）和黑色皮肤上散布白斑（ma型）的个体，野生型（WT型）个体皮肤组织中MC1R基因的表达量最低。

4 讨论

大鲵是我国的特有的二级保护动物，以往有关大鲵生物学特征和资源保护方面的研究较多，分子遗传学方面的研究较少[14]。候选基因法是目前比较常用的功能基因的研究方法，由于大鲵及其近缘物种的基因组数据比较缺乏，没有体色方面的候选基因信息，因此本研究采用了转录组测序的方法，通过构建和分析大鲵皮肤组织转录组文库中MC1R基因的contigs，得到大鲵MC1R基因长295 bp的核苷酸序列。该序列位于基因的编码区，其与人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）等哺乳动物和鸟类的MC1R 同源性在57%～83%，表明MC1R 基因在不同物种间较为保守。

本实验中MC1R 基因mRNA在大鲵的皮肤、胰腺、胃、肺、肝脏、肠、脾脏、生殖腺（卵巢/精巢）、心脏、肌肉中均有表达，其中皮肤组织中的表达量为最高，这与其他物种略有差别。哺乳动物的MC1R 基因主要在毛囊和皮肤黑素细胞中表达[15]。绵羊MC1R基因主要表达部位为毛囊的基质、根鞘等区[16]。新月鱼（X.maculatus） 的MC1R基因在脑、眼、鳃、皮肤、睾丸、肌肉和肝脏都有表达，与青鳉（O.latipes） 的MC1R基因的表达模式相似[17]。橘色双冠丽鱼MC1R 基因在成熟鱼体的鳞片、性腺、肌肉、尾鳍、心、肾、眼、脑、皮肤、鳃、鳔等11种组织中均有表达[18]。研究表明，MC1R在不同物种中其组织表达模式存在较大差异性。

大鲵的基本体色为不同深浅的棕-黑，黑化是比较常见的体色变异类型。在本实验中，大约1/3的大鲵皮肤出现黑化。哺乳动物、鸟类、爬行动物MC1R基因发生突变时，MC1R表达量上升，细胞内大量合成黑色素，使得动物毛色黑化[19-20]。而MC1R基因突变与蜥蜴（L.occipitalis ，L.arambarensis）、欧洲蛙（R.temporaria）体表颜色的加深没有直接的关系[11，21]。在本研究中，大鲵MC1R基因mRNA在am （背部为黄色，尾部为黑色）和ma （背部和尾部主色为黑色，随机散布白斑）黑化型个体中的表达量均高于野生型（深棕色-深灰色），说明大鲵体色黑化可能与MC1R基因的表达量升高有关。

白化症是动物毛色（体色）变化中比较常见的变异类型。研究发现，多种蜥蜴（A.inornata，S.undulates，L.lepida）MC1R基因的碱基替代，导致其编码的MC1R蛋白丧失部分功能，使得蜥蜴背部出现白斑[22-24]。本实验表明，大鲵MC1R基因mRNA在黄色个体皮肤组织中的表达量较野生型相对较高，但差异不显著，说明MC1R基因的表达量与大鲵个体体色的白化不存在显著相关性。Woodcock等[25]研究发现edn3基因突变和tyr基因142 bp的核苷酸缺失与美西钝口螈A.mexicanum个体的白化病存在相关性。鉴于MC1R基因是调控黑色素合成的众多基因之一，大鲵个体体色的白化是否与其下游基因，例如tyr等基因相关，还需进一步进行研究。

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Cloning and Expression Analysis of MC1R in Different Skin Color Phenotypes in Giant Salamanders （Andrias davidianus）

DENG Jie1，WEI Xiaoyan2，ZHANG Han1，MA Hongying1，WANG Qijun1，ZHAO Hu1，ZHANG Hongxing1，JIANG Wei1*

（1.Shaanxi Key Laboratory for Animal Conservation，Shaanxi Institute of Zoology，Xian 710032，China;2.Lishan Animal Husbandry & Veterinary Station， Xian 710600，China）

Abstract：To investigate the relationship between MC1R gene and skin color formation of amphibians，the giant salamander（Andrias davidianus） MC1R gene were cloned and sequence characteristics were analyzed using bioinformatics tools.Meanwhile，by quantitative real-time PCR （qRT-PCR），expression patterns of MC1R gene in ten different tissues and in four types of skin colorphenotypes were detected.The obtained MC1R cDNA were 295 bp long.Multiple sequence alignment indicated the giant salamander MC1R had a high nucleotides similarity with amphibians and reptiles，and it had low similarity with mammalian and bird.These results were further confirmed by phylogenetic tree analysis.Quantitative analysis showed that MC1R mRNA expressed in all tissues in giant salamander，among which the maximum level expression were founded in skin.Besides，MC1R mRNA displayed a higher expression in the melanic skin than other colour phenotypes.The distinctive sequence characteristics and expression pattern suggested that there might be different regulatory mechanism of MC1R gene in skin color formation in giant salamander compare with other species.

Key words：giant salamander（Andrias davidianus）; body color; melanin; MC1R gene; tissue expression

（收稿日期：2020-09-02）

基金項目：陕西省科学院科技计划项目“大鲵体色性状相关基因克隆表达、序列特征及SNP分析”（2014K-19）;陕西省科学院重点项目“秦巴山区大鲵种质资源调查与遗传多样性分析”（2015K-03）。

作者简介：邓捷（1986-），女，助理研究员，硕士，研究方向：水生生物保护与养殖。E-mail：dengjie0311@ms.xab.ac.cn。

通信作者：姜维（1981-），女，副研究员，博士，研究方向：水生生物保护与养殖。E-mail：jiangwei197981@163.com。