桦褐孔菌有效成分的分析研究

2020-10-30王洪峰朱长俊刘兰赵佳茜黄馨怡

生物化工 2020年5期

王洪峰，朱长俊，刘兰，赵佳茜，黄馨怡

（嘉兴学院生物与化学工程学院，浙江嘉兴 314001）

桦褐孔菌（Inonotus obliquus）又名白桦茸，具有良好的药用价值，常用作各种癌症、心脏病、糖尿病和0-157大肠杆菌中毒的治疗剂，还能抑制HIV病毒和抵抗SARS病毒以及增强免疫力等作用。目前，国内对桦褐孔菌的研究较少，主要集中于三萜类化学成分的研究，对桦褐孔菌的功效成分以及机理方面却研究不多，应加大对其的研究力度。对桦褐孔菌的有机提取物进行生物活性检测及成分分析，为这一珍贵药用菌发挥其药理作用提供理论依据[1]。

1 材料与方法

1.1 材料

桦褐孔菌子实体，杭州百山祖生物科技有限公司；大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为本实验室保存。

1.2 仪器与试剂

RE－52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；UV-1100紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；400-MR核磁共振波谱仪，美国瓦里安公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司。

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，分析纯，华东医药股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO），分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司；无水乙醇、丙酮，分析纯，临安市青山化工试剂厂；甲醇，分析纯，上海联试化工试剂有限公司；95%乙醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），如吉生物科技有限公司；硅胶，上海盛亚化工有限公司；氘代氯仿（99.8%），上海易恩化学技术有限公司。

1.3 桦褐孔菌提取物的制备

将桦褐孔菌子实体进行粉碎，过200目筛后加入95%的乙醇中浸泡168 h以上得到乙醇浸泡液（0.32g/mL）。取3份1 000 mL乙醇浸泡液经过滤、抽滤、旋蒸后得80 mL左右的乙醇浸膏，加入100 mL去离子水，再分别加入150～200 mL石油醚、乙酸乙酯或正丁醇进行萃取，得到3种有机溶剂的萃取液，在45 ℃下将萃取液旋蒸至50 mL左右，放入45 ℃烘箱中烘干[2-3]。

1.4 桦褐孔菌提取物的生物活性检测

1.4.1 抑菌活性检测

将提取物溶于DMSO，配成浓度为（50±5）mg/mL的溶液。采用牛津杯法进行实验，加入100 μL样品液，每组3个平行，培养观察，记录数据。

1.4.2 抗氧化活性检测

将提取物用5% DMSO溶解，得到系列浓度（40 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL、120 μg/mL、160 μg/mL）样品溶液；DPPH用95%乙醇溶解得到0.10 mmol/L的溶液，按照表1设置5组试验，每组重复3次，测定每组样品与DPPH溶液反应后的吸光度值（AI）及样品反应前的本底吸光度值（AJ），根据公式1求不同溶剂提取物的DPPH清除率，清除率越高，抗氧化活性越高。

式中，A0代表空白组吸光度，AI代表实验组吸光度，AJ代表样品的本底吸光度。

1.5 有机提取物的柱层析分离提取及产物检测

（1）配制洗脱剂。将石油醚、丙酮按照10∶1、8∶1、5∶1、3∶1、1∶1、1∶3 的比例混合配制洗脱剂。（2）装柱。称15 g硅胶用适量10∶1洗脱剂溶解后装入柱中，并用10∶1洗脱剂淋洗层析柱，使层析柱紧实后静置。（3）上样。将样品加入柱中，依次加入不同比例的洗脱剂。（4）收集。用试管收集产物，5 mL/管，2 mL/min；（5）薄层层析（TLC）检测。把收集到的样品点TLC板。（6）对所得产物继续进行生物活性检测及核磁H谱检测[4]。

2 结果与分析

2.1 提取结果

每20g桦褐孔菌粉末可以获得0.17 g石油醚、0.74 g乙酸乙酯、1.16 g正丁醇提取物。所得的实验数据与文献[2]中数据相近，结果良好。

2.2 提取物生物活性检测结果

2.2.1 抑菌结果

如图1所示，石油醚提取物对金黄色葡萄球菌和大肠埃希杆菌几乎没有抑菌效果；乙酸乙酯、正丁醇提取物对金黄色葡萄球菌有很好的抑菌效果，抑菌圈直径分别为17.5 mm、15.0 mm，但对大肠埃希杆菌的抑菌效果一般，抑菌圈直径分别为9.8 mm、9.2 mm。

图1 桦褐孔菌提取物抑菌结果

2.2.2 抗氧化活性结果

如图2所示，在抗氧化实验中，当提取物浓度小于100 μg/mL，DPPH自由基的清除率与石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取物浓度呈正相关；当浓度为100 μg/mL时，三者的清除率分别为15.05%、89.94%、90.10%，因此乙酸乙酯、正丁醇提取物对DPPH自由基有很好的清除作用。

表1 DPPH清除实验

2.3 提取物分离产物检测

将乙酸乙酯、正丁醇提取物在硅胶柱中进行梯度洗脱得到分离产物，对其进行抗氧化及核磁H谱检测，核磁H谱检测谱图如图3所示。

图2 桦褐孔菌提取物抗氧化性结果

对核磁H谱测定结果进行分析，结果如下。（1）δ：0.66(3H,s)，0.80(3H,s)，0.88(3H,s)，0.96(3H,s)，0.98(3H,s)5个甲基尖峰，属于典型的四环三萜类化合物的特征，5.07(1H)；（2）δ：0.64(3H,s)，0.79(3H,s)，0.90(3H,s)，0.97(3H,s)，0.99(3H,s)5个甲基尖峰，属于典型的四环三萜类化合物的特征，5.04(2H)，9.43(1H)；由于目标产物不是很纯或者溶剂中含量较低，导致产物峰不全或杂乱，故只能推断目标产物的部分结构。通过查阅文献[5-6]，推测产物分别为3β-羟基甘遂酸、3-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛。