限食后重饲大鼠的骨密度变化及白藜芦醇干预效果▲

王素星 邵伟华 李 伟 吕彩霞 张华星 李 芳

(河北省人民医院1 老年病二科，2 老年病一科，3 医务处，石家庄市 050051，电子邮箱：wangsuxing@126.com)

限食后的重饲是指短期热卡限制后重新开放饮食，这可导致能量摄入的波动。不适当限食减肥后饮食反弹、疾病和疾病的康复等均伴随热卡摄取的波动[1]。人体的各种生理活动都离不开能量的支持，能量供应的量与质产生波动均可影响人体的各种生理活动，导致机体代谢发生一系列改变[2]。骨骼代谢与能量供给密切相关，慢性食物剥夺及儿童期营养不良均对骨代谢有负面影响。有研究显示，营养剥夺可激活自噬，后者抑制成骨细胞分化增殖，促进破骨细胞分化[3]，进而负性调控骨代谢。白藜芦醇是一种存在于红酒中的多酚，可以抑制脂肪生成，刺激脂肪分解，增加脂肪酸氧化和热生成[4]。同时，白藜芦醇能明显促进成骨细胞DNA合成，使成骨细胞内碱性磷酸酶和脯氨酰羟化酶活性明显增加[5]，也可通过减轻氧化应激引起的损伤抑制骨质流失[6]，由此可见白藜芦醇与骨代谢亦密切相关。双能 X线吸收测量(dual energy X-ray absorptiometry,DEXA)的辐射量较小，具有更高的精确度，已经成为临床上测量骨密度的常用方法[7]。本研究通过限制热卡再快速恢复不同饮食模式的方法，建立限食后重饲成年大鼠模型，采用DEXA检测全身骨密度，观察能量供给改变过程中不同膳食模式重饲对骨密度的影响，以及白藜芦醇的干预效应及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 无特定病原体级SD雄性大鼠64只，体质量(160±20)g，购自河北医科大学科研实验动物饲养中心。实验动物质量合格证号:SCXK(冀)2013-1-003。大鼠常规喂养。

1.2 试剂及仪器 电子秤(精确到0.1 g)购自佛山市顺德区山和电子衡器有限公司(型号：SH0001)；血糖仪购自强生(中国)医疗器材有限公司(型号：ONE TOUCH UltraVue)；微量输注泵购自浙江大学医学仪器有限公司(型号：WZ-50G)；DEXA仪购自美国GE Lunar公司(型号Lunar iDXA)。重组人胰岛素购自诺和诺德(中国)制药有限公司(批号国药准字：J20130021)；血清胰岛素酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)ELISA试剂盒、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)ELISA试剂盒均购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司(批号：E-EL-R2466c、E-EL-R1860c、E-EL-R0019c、E-EL-R0015c)。普通饲料购自河北医科大学实验动物学部，高脂饲料参考相关文献[8]进行配制。白藜芦醇(粉剂，纯度99%，Sigma公司)用生理盐水配制成15 mg/mL悬浊液备用。

1.3 研究方法 适应性喂养大鼠1周后，使用随机数字表将其分为正常饮食组16只、限食后重饲组24只、限食后重饲+白藜芦醇干预组24只。再将正常饮食组分为NC4组和NC12组各8只，整个实验过程均给予正常饮食；限食后重饲组分为3个亚组各8例，即R4组(限食4周)、RN组(限食4周后给予正常饮食8周)、RH组(限食4周后给予高脂饮食8周)；限食后重饲+白藜芦醇干预组分为3个亚组各8例，即R4R组(限食4周的同时给予白藜芦醇干预)、RNR组(限食4周后给予正常饮食加白藜芦醇8周干预)、RHR组(限食4周后给予高脂饮食加白藜芦醇干预8周)。限食后重饲组及限食后重饲+白藜芦醇干预组大鼠限食期间均给予60%正常饮食组大鼠的食量喂养；限食后重饲+白藜芦醇干预组大鼠在饮食干预期间给予100 mg/kg白藜芦醇灌胃，其他两组大鼠给予等量生理盐水灌胃，1次/d，直至实验结束。分组示意图见图1。

图1 分组示意图

1.4 观察指标

1.4.1 体重：每日称量大鼠体重及食物摄入量(精确至0.1 g)。

1.4.2 全身骨密度测定：在实验第4周末(NC4组、R4组、R4R组)和第12周末(RN组、RH组、RNR组、RHR组)，大鼠禁食过夜，精确称量体重后，按30 mg/kg腹腔注射戊巴比妥钠，待大鼠肌力消失、呼吸平稳，仰卧位下用胶带将大鼠四肢固定于硬纸板，采用DEXA仪从鼻尖扫描至尾端行全身骨密度测定。

1.4.3 高胰岛素-正糖钳夹试验检测：在实验第4周末(NC4组、R4组、R4R组)和第12周末(RN组、RH组、RNR组、RHR组)，大鼠限食过夜后，参考文献[9]，在大鼠清醒状态下行尾动静脉插管高胰岛素-正糖钳夹试验(以下简称正糖钳夹试验)，检测钳夹60～120 min内葡萄糖输注率(glucose infusion rate during 60 to 120 minutes,GIR60-120)。正糖钳夹试验开始前留取尾静脉空腹血。

1.4.4 FFA、TNF-α、IL-6的检测：取1.3.3留取的血标本，离心(3 000 r/min，15 min)，留取血清，采用ELISA检测FFA、TNF-α、IL-6水平，所有操作均按试剂盒说明进行。

1.5 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析。符合正态分布的两指标相关分析采用Pearson相关分析，不符合正态分布的两指标相关分析采用Spearman相关分析。采用多元逐步回归分析全身骨密度与各个变量之间的关系，同时行共线性检验，排除相关性强的影响因素。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 限食对大鼠体重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影响 实验第4周末，NC4组、R4组、R4R组的体重、骨密度依次降低(均P<0.05)；NC4组、R4R组、R4组的血清FFA水平依次升高(均P<0.05)，而3组间GIR60-120差异无统计学意义(P>0.05)；R4组、R4R组的血清TNF-α和IL-6水平均低于NC4组(均P<0.05)，但R4组、R4R组差异无统计学意义(均P>0.05)。见表1。

表1 NC4组、R4组、R4R组各指标比较(x±s)

2.2 限食后重饲情况对大鼠体重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影响 实验第12周末，RN组、RH组的体重均低于NC12组(均P<0.05)，但RN组与RH组差异无统计学意义(P>0.05)；RH组的骨密度低于其他两组(均P<0.05)；NC12组、RN组、RH组GIR60-120依次降低，而血清FFA、TNF-α、IL-6水平依次升高(均P<0.05)。见表2。

表2 NC12组、RN组、RH组各指标比较(x±s)

2.3 限食后正常饮食及白藜芦醇干预对大鼠体重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影响 实验第12周末，NC12组、RN组、RNR组的体重依次降低，RNR组骨密度高于其他两组(均P<0.05)；RNR组GIR60-120高于NC12组(P<0.05)；NC12组、RNR组、RN组的血清FFA、TNF-α水平依次升高，且RN组血清IL-6水平高于其他两组(均P<0.05)。见表3。

表3 NC12组、RN组、RNR组各指标比较(x±s)

2.4 限食后高脂饮食及白藜芦醇干预对大鼠体重、骨密度、GIR60-120以及血清FFA、TNF-α和IL-6水平的影响 实验第12周末，NC12组、RH组、RHR组的体重依次降低，RH组、NC12组、RHR组的骨密度依次升高，NC12组、RHR组、RH组的GIR60-120依次降低，血清FFA、TNF-α、IL-6水平依次升高(均P<0.05)。见表4。

表4 NC12组、RH组、RHR组各指标比较(x±s)

2.5 影响骨密度的因素 取12周组大鼠，分析其骨密度与体重、GIR60-120值及FFA、TNF-α、IL-6水平的相关性。相关分析结果显示全身骨密度与体重、GIR60-120呈正相关(r=0.634，P<0.001；r=0.745，P<0.001)，与血清FFA、TNF-α、IL-6水平呈负相关(r=-0.721，P<0.001；r=-0.644，P<0.001；r=-0.613，P=0.013)。以骨密度为因变量，体重、GIR60-120值及FFA、TNF-α、IL-6水平为自变量进行逐步回归分析(均纳入实际测量值进行分析)，结果显示GIR60-120、FFA水平是影响全身骨密度的因素(均P<0.05)。见表5。

表5 骨密度影响因素的多因素分析

3 讨 论

本研究中，RH组大鼠骨密度低于NC12组及RN组(P<0.05)，而NC12组及RN组差异无统计学意义(P>0.05)，提示限食后给予高脂饲料重饲可导致大鼠骨密度降低。研究表明，胰岛素抵抗可影响1α-肾羟化酶的活性，以及肾脏对钙、磷的调节，导致钙流失增多；其还可以导致甲状旁腺激素等激素分泌异常，进而影响骨代谢[10]。正糖钳夹试验中GIR60-120是评价胰岛素敏感性的重要指标，本研究结果显示，NC12、RN组、RH组的GIR60-120依次降低(P<0.05)，提示限食后给予高脂饲料重饲大鼠存在更为严重的胰岛素抵抗；同时大鼠的GIR60-120与骨密度呈正相关，是骨密度的影响因素(P<0.05)，提示限食后给予高脂饲料重饲大鼠出现的更为严重的胰岛素抵抗导致骨密度降低。有学者发现，脂肪酸对成骨细胞具有脂毒性作用[11],抑制脂肪细胞内脂肪酸的合成可以保护成骨细胞。有研究表明，营养变迁过程中内脏脂肪组织的脂质生成能力增强，而储存能力相对不足[1]。本研究结果显示，RN组及RH组大鼠分别给予正常饲料及高脂饲料重饲后FFA水平均升高(P<0.05)，考虑与脂质生成和储存失衡导致的脂质外溢有关；同时，FFA水平与骨密度呈负相关(P<0.05)，提示血清中蓄积的FFA达到一定程度可能会对骨质产生破坏作用；而RH大鼠FFA水平高于RN组(P<0.05)，表明高脂饮食重饲后显著升高的FFA水平可能是骨密度降低的影响因素之一。

核转录因子-κB受体激活因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)是肿瘤坏死因子超家族的成员，在破骨细胞前体向破骨细胞的分化中起着关键作用[12]，可以促进骨吸收。当机体存在炎症反应时，TNF-α、IL-6等炎性物质使组织处于一种“慢性炎症”环境中，RANKL表达上调，骨吸收被抑制。本研究中，分别给予正常饲料及高脂饲料重饲后，RN组和RH组大鼠的TNF-α、IL-6水平升高，且RH组的水平更高(P<0.05)。TNF-α、IL-6是经典的炎症因子，因此我们推测高脂饲料重饲后出现骨密度降低，可能与其机体更为严重的炎症反应对骨代谢影响更为明显有关。

白藜芦醇，化学名称为3,5,4′-三羟基二苯乙烯，是一种结构类似雌激素己烯雌酚的天然多酚类化合物，广泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[13]。研究显示，白藜芦醇在体外能与雌激素竞争性结合雌激素受体，具有雌激素/抗雌激素样作用，被视为一种植物雌激素，而雌激素对骨质疏松有治疗作用[14]。本研究结果显示，与单纯限食后重饲组(RN组及RH组)比较，限食后无论给予正常饲料还是高脂饲料重饲，白藜芦醇干预组(RNR组及RHR组)的大鼠骨密度升高，且GIR60-120亦升高，FFA、TNF-α、IL-6水平均降低。这提示白藜芦醇可能通过降低胰岛素抵抗，减少FFA生成从而升高大鼠骨密度；同时白藜芦醇还可能通过减少脂质外溢、减轻炎症反应，进而纠正骨代谢的内环境，促进骨生成。此外，与单纯限食后重饲组比较，限食后无论给予正常饲料还是高脂饲料重饲，白藜芦醇干预组的大鼠体质量下降，但骨密度升高(P<0.05)。因此，我们认为独立于体质量的重力负荷和机械刺激外，白藜芦醇可能通过其他途径发挥骨保护作用。有研究显示，白藜芦醇可通过多种途径正性调控骨代谢。例如，核心结合因子α-1是最早发现且最具特异性的成骨标志物，沉默信息调节因子-1通过去乙酰化核心结合因子α-1，直接调节核心结合因子α-1，促进成骨细胞的增殖和分化[15]，而白藜芦醇作为最有效的沉默信息调节因子-1的激活剂之一[6，16]，在该过程发挥重要作用。白藜芦醇还可激活腺苷酸活化蛋白激酶，后者通过调节Wnt/β-连环蛋白信号通路影响成骨细胞功能[17]。但本研究结果亦显示，限食4周的同时给予白藜芦醇干预的R4R组大鼠骨密度低于单独限食的R4组，出现这一现象的原因可能是：食物剥夺使得骨形成所需的基本原料减少，从而抑制了成骨细胞的活性；同时，相对严重的食物缺乏(减少40%的食物摄入)激活了机体能量守恒机制，能量被优先分配到关键器官，以确保生命的基本代谢活动，导致白藜芦醇无法发挥骨骼的保护作用。因此，我们考虑白藜芦醇的骨骼保护作用还依赖于机体能量供给。

综上所述，与正常饮食重饲相比，高脂饮食重饲大鼠全身骨密度及胰岛素敏感性下降更明显，白藜芦醇可能通过改善限食后重饲大鼠的胰岛素抵抗，降低FFA生成及炎症因子释放，从而提高骨密度。但这种对骨骼的保护作用有赖于充足的营养供应，而白藜芦醇在营养变迁大鼠模型中对骨代谢影响的具体分子生物学机制还需要进一步深入研究。