苦参碱对大鼠肝缺血再灌注损伤后肝功能及MAPK通路的影响

袁芳，杨智承

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

肝移植、肝切除术中，需分次、分段阻断肝脏血流，达到控制术中出血的目的，该过程会造成肝脏的缺血再灌注损伤(hepatic ischemic reperfusion injury ,HI/R)[1]。研究显示，HI/R可造成肝窦内细胞损伤，并诱导活性氧自由基，释放促炎症反应细胞因子，引发肝细胞坏死、诱导肝细胞凋亡，最终导致肝功能异常，是肝脏手术的常见死亡原因[1-2]。近年来研究显示，肝细胞凋亡在HI/R的病理过程中发挥重要作用[3]。

目前，针对肝缺血再灌注损伤，临床以对症支持治疗为主，仍缺乏有效措施，亟待寻求预防HI/R的有效手段。国内外多项研究显示，中药单体苦参碱(matrine，MT)有抗氧化、抗炎和护肝等作用[4-5]，对于缺血再灌注有保护作用[6-8]，但MT对于肝缺血再灌注的作用和机制仍需进一步阐明。本研究在建立大鼠HI/R模型[9]的基础上观察 MT对HI/R的作用并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

苦参碱(质量分数≥99%) 购于中国药品生物制品检定所,生产批号：110805-201509；BCA蛋白浓度检测试剂和NE-PERTM细胞核和胞浆提取试剂盒均购于Pierce Biolab 公司；MAPK家族一抗：ERK1/2、p38、JNK、MKK7抗体及内参GAPDH购于Cell Sigaling Technology公司；TUNEL染色试剂盒由美国Promega公司生产；丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒购于南京建成生物工程公司。

1.2 仪器与设备

Hitachi7180临床分析仪、5810冷冻离心机(Eppendorf)；OlympusCKX41倒置显微镜(奥林巴斯)；-80 ℃超低温冰箱(Thermo Scientific)；免疫印迹系统(BioRad)；680XHR凝胶成像系统(GBOX)。

1.3 实验动物

清洁级SD雄性大鼠，体质量200～250 g，购于南方医科大学实验动物中心，生产许可证号： SCXK(粤)2019-0005。

1.4 分组与给药

健康成年雄性SD大鼠24只，随机分为4组，每组6只：(1)肝缺血再灌注组(I/R组):连续7 d腹腔注射含1%吐温80生理盐水；(2)苦参碱(MT组)：给药剂量分别为20、40 mg/kg，溶解于含1%吐温80生理盐水，连续7 d腹腔注射。该剂量由临床常用苦参碱剂量折算[10- 11]，并通过预实验确定给药天数。(3)假手术组(Sham组):连续7 d腹腔注射含1%吐温80的生理盐水。

1.5 模型建立

大鼠术前禁食12 h，自由饮水。I/R组和MT组分别给予溶媒和苦参碱30 min后，经腹腔注射4%(φ)戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉，固定，常规消毒。取上腹正中切口入腹，用无创血管夹阻断肝门静脉和肝动脉，造成约70%肝脏缺血。1 h后去除血管夹，恢复缺血肝的血流，缝合腹腔，继续再灌注4 h，取左叶肝脏组织标本和下腔静脉血待测；Sham组给予同体积生理盐水溶媒腹腔注射30 min后，开腹及暴露肝蒂处理后，关腹，不阻断肝血流，然后缝合腹腔，4 h后同上取样本待测[9]。

1.6 标本处理

所有血浆样本，常温离心15 000 r/min×15 min，取上清-80 ℃冻存。肝组织用PBS清洗后，冻存于液氮中，待测。检测时，解冻肝组织，称重，用1∶10(v∶v)的冰浴PBS匀浆，4 ℃，14 000×g离心15 min。分离上清，分别测定酶活性和蛋白定量。肝组织10%(φ)甲醛固定，石蜡包埋制成蜡块备用。将包埋肝组织蜡块进行修块、脱水、包埋、切片等处理后，按照说明，分别进行HE染色和TUNEL染色。另取5 g肝组织，破碎离心后，用于Western blot检测。

1.7 谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、MDA和SOD的检测

血清ALT、AST用Hitachi7180临床分析仪进行检测。按照说明书，利用酶比色法试剂盒测定组织中MDA、SOD的含量。

1.8 组织病理学检测

HE染色后，在光学显微镜下进行肝组织的病理形态学观察。

1.9 TUNEL法检测肝细胞凋亡

每个切片随机选取10个阳性视野，以细胞内出现棕色颗粒者为凋亡细胞，计算每张切片中的凋亡细胞数目。

1.10 Western blot检测

肝脏组织在冰上用含有10 mmoL/L Tris (pH 7.5)，1.5 mmoL/L MgCl2，10 mmoL/L KCl 和0.1% Trition X-100的缓冲液中混悬、匀浆裂解，12 000 r/min,4 ℃离心15 min，取上清收集总蛋白。5×上样缓冲液混合煮沸5 min。垂直板电泳分离条带，转膜，分别加入GADD45Β、MMK7、MAPK家族蛋白ERK1/2、磷酸化ERK1/2、磷酸化p38、p38、磷酸化JNK和JNK一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，洗膜后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2 000，HRP标记)孵育2 h，利用化学发光仪器曝光，采集目标蛋白条带。Western blot图像灰度值采用Quantity One2.4软件分析。

1.11 统计学处理

采用SPSS18.0软件处理数据，各组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血浆ALT、AST和组织中MDA、SOD的比较

血清学检测结果提示：与假手术组比较，I/R组血清ALT、AST水平均显著升高(P<0.01);MT(20、40 mg/kg)组血清ALT、AST水平与I/R组比较显著降低(P<0.01)，且高剂量组的降低程度较低剂量组更显著(见表1 )。

与假手术组比较,I/R组组织中MDA、SOD含量均显著增加(P<0.01); MT(20、40 mg/kg)组组织中MDA与I/R组比较显著降低、SOD含量增高(P<0.01或P<0.05)(见表1)。

2.2 各组肝组织病理学变化

HE染色肝组织，显微镜下可见：Sham组肝索排列规则，肝窦不扩张，仅少量炎性细胞浸润。I/R组肝组织肿胀、肝窦扩张，肝细胞空泡变性和点状坏死，周围有大量红细胞和炎性细胞浸润，伴有空泡变性和点状坏死。 MT 20、40 mg/kg组肝细胞结构清楚，肝细胞肿胀程度和炎性细胞浸润情况，均较I/R组有所减轻(见图1)。

2.3 TUNEL检测各组肝细胞凋亡情况

TNUEL检测结果显示，I/R组、MT 20、40 mg/kg组均有一定数量的TUNEL阳性细胞。较之I/R组，MT 40 mg/kg组降低明显(P<0.01),见图2。

2.4 Western blot结果

2.4.1 各组ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38和p-p38的表达情况 与Sham组比较， I/R组和MT组的p-JNK和p-p38蛋白表达显著增加 (P<0.01)；与I/R组比较，MT 20、40 mg/kg组p-JNK、p-p38表达显著降低(P<0.05)，对于p-ERK1/2则无明显影响，见图3。

2.4.2 各组MKK7的表达情况 Sham组仅有少量MKK7表达；与Sham组比较，I/R组MKK7的表达显著升高(P<0.01)，MT组可以显著降低MKK7表达(P<0.05)，见图4。

表1 各组ALT、AST、MDA和SOD水平比较Table 1 Comparison of the levels of ALT,ALT,MDA and SOD in each group

A. Sham 组； B. I/R组； C.MT 20 mg/kg组；D. MT 40 mg/kg组。

p-ERK1/2ERK1/2p-JNKJNKp-p38p381234p-ERK1/2p-JNKp-p38543210****####1234AB蛋白相对表达量

3 讨论

中药单体苦参碱具有抗氧化[12]、抗炎、抗代谢等一系列作用[7,13]，有报道苦参碱术前单次静脉注射，可以通过TRAIL/BAX途径抑制大鼠肝缺血-再灌注损伤后的肝细胞凋亡[13]。但报道多为一次性术前预防给药，与临床治疗模式不符，且苦参碱对于凋亡的作用机制仍有待进一步阐明。因此本研究在建立大鼠HI/R模型的基础上，将临床常用苦参碱剂量折算成动物给药剂量[10-11]，大鼠连续7 d给予苦参碱(20、40 mg/kg)腹腔注射后，实施肝缺血再灌注术，术后立即采样，保存标本。肝功能各项指标显示：苦参碱组AST和ALT的含量，肝组织中脂质过氧化反应产物MDA含量明显低于肝缺血再灌注组(P<0.01)，肝组织中的抗氧化酶SOD含量，则高于肝缺血再灌注组(P<0.01)。病理学检查发现，肝缺血再灌注组的肝组织标本可见大量炎性细胞浸润，肝窦扩张，肝细胞空泡变性并有多处坏死灶；苦参碱高剂量组的肝小叶结构基本正常，肝细胞坏死、炎症细胞浸润均较肝缺血再灌注组明显减少；苦参碱低剂量组的肝组织损伤也较肝缺血再灌注组轻。结果提示苦参碱连续给药预处理，有助于缓解肝缺血再灌注损伤，具有护肝作用。

蛋白相对表达量1234AB2.01.51.00.50.0MMK71234MKK7GAPDH#*

本研究同时检测了各组肝细胞的凋亡情况，结果显示，苦参碱高剂量组能够明显减少缺血再灌注后的肝细胞凋亡，低剂量组对凋亡也有改善趋势。

多项研究均显示，在肝缺血再灌注损伤引发的肝坏死、术后死亡等一系列问题中，诱导肝细胞凋亡发挥着至关重要的作用[2]，而丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路在调控肝细胞凋亡的作用已被诸多研究证实[1,14-15]。MAPK是一组能被不同的细胞外刺激如：细胞因子、神经递质、激素等激活的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，包括ERK、JNK、p38 MAPK和ERK5四个亚族[16]，其中p38和C-Jun 氨基末端激酶(c-JunN-terminal kinase,JNK)通路的磷酸化激活和细胞凋亡与应激时的多种病理生理过程有关[17-18]。

为探讨苦参碱发挥肝缺血再灌注保护作用的机制，进一步研究了苦参碱预处理对于肝缺血再灌注肝组织中MAPK通路的JNK、p38和ERK表达的影响。研究显示，苦参碱预处理可显著降低肝缺血再灌注肝组织中磷酸化JNK、p38表达，且对磷酸化JNK的表达影响最为显著。JNK在多种组织中均有表达，能被MAPK激酶MKK7特异性激活[18-19]。反之，抑制MKK7的特异位点，可以最终达到抑制JNK磷酸化，发挥抗凋亡的作用[20]。本研究进一步观察了苦参碱预处理对于调控JNK磷酸化的MKK7表达，结果显示，苦参碱预处理可以显著降低JNK的调控激酶MKK7的表达，因此苦参碱抗肝缺血再灌注的机制可能与抑制MKK7表达，降低JNK磷酸化有关。

综上所述，苦参碱预处理对大鼠肝缺血再灌注损伤有一定的保护作用，其可能机制与抑制MAPK通路的MKK7/JNK磷酸化以及p38磷酸化，发挥抗肝细胞凋亡作用有关，对于苦参碱预防肝缺血再灌注损伤的临床意义有待进一步研究，其相关信号通路的上游调控机制也有待进一步明确。