基于多元统计分析的金银花、山银花及川银花质量评价研究

邱连建，索彩仙，潘礼业，李国卫，胡绮萍，孙冬梅

(1.北京中医药大学深圳医院(龙岗)，广东 深圳 518000； 2.广东一方制药有限公司/广东省中药配方颗粒企业重点实验室，广东 佛山 528244)

忍冬始载于《名医别录》，《新修本草》和《证类本草》等古籍均有收录[1]。目前，市面上流通较广的忍冬药材主要有金银花、山银花、川银花，其中金银花、山银花为2020年版《中国药典》收载品种，川银花为2010年版《四川省中药材标准》收载品种[2-3]。《中国植物志》中记载了忍冬科植物在我国有98种之多，广泛分布于全国各省区，其中金银花以山东平邑、河南封丘为主要产区，山银花主产于湖北、云南、贵州、广西等东南地区和西南地区，川银花则主产于四川，3者均具有清热解毒、疏散风热、抑菌抗菌、抗病毒的功能，主治痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒以及温病发热等病症[4-5]。

在2005年版之前的《中国药典》中，金银花和山银花作为同一种药材收载，2005年版《中国药典》正式将金银花和山银花进行区分，有关两者的研究较多[6-12]。金银花、山银花、川银花在成分、功效主治方面十分接近。鉴于金银花为药食同源，现阶段虽人工种植已成规模，仍供不应求，所以药材市场仍存在掺伪混淆等现象，因此，金银花与同科属其他相关药材的鉴别仍十分必要。

本文对金银花、山银花、川银花3种不同忍冬科药材进行了研究，在建立多指标含量测定的基础上，结合聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判别分析，比较不同忍冬科药材的差异性，为忍冬科药材鉴别和质量评价提供了参考。

1 仪器与材料

Waters H-Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters BEH Phenyl 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 mm)；Mettler XP-26型百万分之一天平、ME204E型万分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q型超纯水净化系统(美国Millipore公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；甲醇、乙腈为色谱纯(Merk)；水为Mili-Q纯化水；其余试剂为分析纯。

绿原酸(批号：110753-201817，质量分数：96.8%)、马钱苷(批号：111640-201808，质量分数：99.0%)、芦丁(批号：10080-201811，质量分数：91.7%)、木犀草苷(批号：111720-201609，质量分数：94.9%)对照品，由中国食品药品检定研究院提供；异绿原酸A(批号：wkq18041207，质量分数：98%)、异绿原酸B(批号：wkq17060705，质量分数：98%)、异绿原酸C(批号：wkq18050905，质量分数：98%)、隐绿原酸(批号：wkq16081903，质量分数：98%)、新绿原酸(批号：wkq16050805，质量分数：98%)、獐牙菜苷(批号：wqk17092203，质量分数：98%)对照品，由四川省维克奇生物科技有限公司提供；实验所用药材经广东一方制药有限公司魏梅主任中药师鉴定，J01～J12为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或带初开的花；S01～S12为忍冬科植物黄褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花；C01～C12为忍冬科植物淡红忍冬L.acuminataWall.的干燥花蕾或带初开的花。药材详情信息见表1。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

分别取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷、异绿原酸B、绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，精密称定，加甲醇制成浓度分别为12.201、456.609、7.901、7.790、14.906、17.916、11.851、8.129、270.480、30.679 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%(体积分数，下同)甲醇50 mL，超声处理(功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

采用Waters BEH Phenyl(100 mm×2.1 mm，1.7 mm)色谱柱；流速为0.3 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为240 nm；进样量为1 μL，以乙腈(A)-0.1%磷酸(B)为流动相，梯度洗脱(0～1 min，4%→5%A；1～9 min，5%→6%A；9～13 min，6%→10%A；13～15 min，10%→14%A；15～30 min，14%→25%A)。色谱图见图1。

表1 药材详情信息表Table 1 Information of medicinal material

ABCD051015202530t/min7891065432178910654321891032189104321

2.4 方法学考察

2.4.1 线性范围 取“2.1”项混合对照品溶液，加甲醇稀释制得6个不同质量浓度的对照品溶液，以峰面积为纵坐标、质量浓度(μg/mL)为横坐标进行线性回归，结果见表2。可见，各个对照品的线性关系良好。

2.4.2 精密度试验 取同一供试品溶液(J03)，按“2.3”项色谱条件，连续进样6次，结果测得10种成分峰面积的RSD值均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一供试品溶液(J03)，按“2.3”项的色谱条件，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定，结果测得10种成分峰面积的RSD值均小于2%，表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4.4 重复性试验 取样品粉末(J03)约0.5 g，平行6份，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.3”项色谱条件测定，结果测得10种成分峰面积的RSD小于2%，表明方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密称取样品粉末(J03)0.25 g，平行6份，加入与样品中含量等量的对照品，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进行测定，结果测得10种成分的平均加样回收率均在94.15%～106.79%范围内，RSD值均小于3%，见表3。

2.5 结果与分析

2.5.1 质量分数测定结果 精密称取36批样品，按“2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进样测定，结果见表4。可见，3种药材的10种成分质量分数存在显著差异，RSD值在48.18%～153.83%之间。其中，RSD值大于80%的包括5个成分，分别为隐绿原酸、马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷，经过分析多批次样品，发现獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷为金银花的特有成分；马钱苷在金银花和川银花两类样品能检出；新绿原酸为3种样品的共有成分，但在川银花中质量分数最高，均值为2.264 mg/g，金银花与山银花中的分别为0.707、0.613 mg/g。绿原酸为2015年版《中国药典》中金银花的规定指标成分，本文结果显示：绿原酸在金银花中的质量分数较高且较稳定，均值为27.215 mg/g，组内RSD为4.50%；在山银花中较低，且不稳定，均值为9.600 mg/g，组内RSD为54.09%；在川银花中最高且稳定，均值为48.556 mg/g，组内RSD为1.28%。

表2 10种成分的回归方程及线性范围Table 2 Regression equation and linear range of 10 ingredients

表3 10种成分的加样回收率试验结果Table 3 Recovery results of 10 ingredients(n=6)

表4 36批样品含量测定结果

表4 (续)

2.5.2 聚类分析 运用SPSS软件对36批药材样品10种成分的质量分数测定结果进行系统聚类，采用组间平均数联结法，以余弦距离作为样品相似度的距离公式，样品聚类分析图见图2。可见，36批样品聚为3类，J01～J12为金银花聚为一类，S01～S12为山银花聚为一类，C01～C12为川银花聚为一类。

2.5.3 主成分分析(PCA) 以10种成分质量分数测定结果为变量，采用SPSS 22.0软件进行主成分分析，由表5可见，共提取了2个特征值大于1的主成分，累积方差贡献率达93.996%，表明可以用2个主成分反映不同基原忍冬科药材主要的质量特征。从表6可见，在第1主成分有较高载荷的包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、马钱苷，主要为酚酸类成分；在第2主成分有较高载荷的包括獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷，主要为黄酮类成分。从表7降维得到的2个主成分得分(载荷值>0.90)结果显示，金银花样品主成分2评分均为正值，川银花样品主成分1评分均为正值，山银花样品则2个主成分评分均为负值，因此，从主成分的评分可以对不同样品实现区分。

0510152025333631293230262734283525222313242021181917141615675891112410312YC09C12C07C05C08C06C02C03C10C04C11C01S10S11S01S12S08S09S06S07S05S02S04S03J06J07J05J08J09J11J12J04J10J03J01J02

表5 特征根、各主成分的贡献率Table 5 Contribution rate of characteristic roots and principal components

表6 各因子初始因子载荷矩阵Table 6 Initial factor load matrix of each factor

表7 主成分得分Table 7 Principal component score

2.5.4 正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA) 依据PCA结果，对3种不同药材样品进行OPLS-DA分析。该OPLS-DA模型，R2X(cum)=0.940，R2X(cum)=0.987，Q2(cum)=0.985，均大于0.5，说明模型稳定可靠，可用于忍冬科不同药材样品的区分。从图3可见，数据的分类算法中OPLS-DA的效果较好，可使3种样本点完全被分开，相互之间没有样品出现交叉的情况，且全部样品均位于95%可信区间之内。采用变量重要性投影值( variable importance in project，VIP) 筛选造成3种基原忍冬科样品差异性的标志物，其中VIP值大于1的成分包括5个，分别为芦丁、木犀草苷、獐牙菜苷、绿原酸、马钱苷，是导致3种不同忍冬科药材样品间差异的主要标志性成分，其余峰VIP值小于1，对样品的区分影响较小，结果见图4。

图3 36批样品的OPLS-DA得分图Figure 3 OPLS-DA score of 36 batches of samples

图4 10个化学成分的VIP值Figure 4 VIP values of 10 ingredients

3 讨论

金银花成分主要以酚酸类为主，故关于金银花研究多以350 nm为检测波长，但本研究是对3种不同忍冬科药材的系统分析，考虑到兼顾其他成分，通过全波长扫描，发现240 nm检测波长所得到的色谱峰较350 nm的色谱峰信息多，且峰型较好，故选用240 nm作为检测波长。

王莹[13]、黄玉娟等[14]均对金银花与山银花的质量差异进行了探讨，结果显示绿原酸、芦丁、木犀草苷等成分在2种药材中的含量存在差异，但尚未有川银花与金银花、川银花差异比较的文献报道。本研究对3种忍冬科药材的10种成分进行了定量分析，结果显示金银花、山银花、川银花组内具有共性规律，但组间存在明显差异。其中，直观结果分析显示，金银花含有3个特有成分(獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷)，山银花则不含有马钱苷，而新绿原酸为最直观反映3种药材差异的共有成分，其含量大小为川银花>金银花>山银花，绿原酸亦呈现同样规律。聚类分析、主成分分析、OPLS-DA分析结果一致，均能将3种忍冬科药材进行区分，提示芦丁、木犀草苷、獐牙菜苷、绿原酸、马钱苷等成分可能为区分3种忍冬科药材的质量标准物。川银花作为四川地区的习用品，其功效主治与金银花、山银花具有一定的相似性。本研究通过对比研究发现其成分与后两者具有一定的相似性，为阐明其药效物质基础提供参考，同时本研究在山银花中未检出马钱苷、獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷，在川银花中未检出獐牙菜苷、芦丁、木犀草苷，建立的方法可对3种药材进行鉴别，也为3种药材的质量控制提供了参考方法。

本研究建立了忍冬科药材10个指标成分的UPLC含量测定方法，对36个不同药材样本进行了测定，并采用聚类分析、主成分分析与正交偏最小二乘法-判别分析对含量测定结果进行了分析，分析结果显示3种不同忍冬科药材存在一定差异，为忍冬科药材的质量控制提供了可靠的分析方法与参考依据。